Тримата носители на Нобеловата награда за физиология или медицина за 2019 г., Уилям Г. Каелин, младши, Грег Л. Семенза и сър Питър Дж. Ратклиф вече бяха спечелили наградата Ласкър за 2016 г. за основна медицина за работата си върху това как клетките усещат и се адаптират до хипоксия, така че не беше особено изненадващо. Те откриха и идентифицираха ключовата молекула хипоксия-индуцируем фактор 1 (HIF-1). Днес искаме да се върнем към произхода на изследването, което е еритропоетинът или EPO, една чудотворна молекула.

Това е най-важният фактор за производството на червени кръвни клетки

Червените кръвни клетки са най-разпространеният тип кръвни клетки в кръвта и са основната среда за транспортиране на кислород и въглероден диоксид през кръвта на гръбначните животни. Еритроцитите се генерират в костния мозък: Хемопоетичните стволови клетки първо пролиферират и се диференцират в прогенитори на различни кръвни клетки, а еритроидните прогенитори могат допълнително да се диференцират и узряват в еритроцити. При нормални условия скоростта на производство на еритроцити при хора е много ниска, но при стрес, като кървене, хемолиза и хипоксия, скоростта на производство на еритроцити може да се увеличи до осем пъти. В този процес еритропоетин ЕРО е един от най-важните фактори.

EPO е хормон, синтезиран главно в бъбреците. Химическата му природа е силно гликозилиран протеин. Защо в бъбреците? Около един литър кръв протича през бъбреците всяка минута, така че те могат бързо и ефикасно да открият промените в нивата на кислород в кръвта. Когато нивата на кислород в кръвта са ниски, бъбреците реагират бързо и произвеждат големи количества EPO. Последният циркулира през кръвния поток до костния мозък, където подпомага превръщането на еритроидните прогениторни клетки в червени кръвни клетки. Зрелите червени кръвни клетки се освобождават от костния мозък в кръвоносната система, за да подобрят способността на тялото да се свързва с кислорода. Когато бъбреците усетят увеличение на кислорода в кръвта, те намаляват производството на EPO, което от своя страна намалява количеството червени кръвни клетки в костния мозък.

Това прави перфектен контур за регулиране. Въпреки това, хората, живеещи на голяма надморска височина, и някои пациенти с анемия често се сблъскват със състоянието на непрекъснато ниско ниво на кислород в кръвта, което не може да завърши горната циркулация и да стимулира бъбреците непрекъснато да отделят ЕРО, така че концентрацията на ЕРО в кръвта да е по-висока от обикновените хора.

Разкриването му отне близо 80 години

Подобно на много големи открития, разбирането на учените за EPO не е гладко, с въпроси и предизвикателства по пътя. Изминаха близо 80 години от концепцията за EPO до окончателното определяне на конкретната молекула.

През 1906 г. френски учени Карно и Дефландр инжектират нормални зайци със серум от анемични зайци и установяват, че броят на червените кръвни клетки в плазмата на нормалните зайци се увеличава. Те вярват, че някои хуморални фактори в плазмата могат да стимулират и регулират производството на червени кръвни клетки. Това беше първият концептуален прототип на EPO. За съжаление, резултатите не са повторени през следващите десетилетия, главно защото броят на новите червени кръвни клетки не е точен.

Експериментът с парабиоза на Reissmann и Ruhenstroth-Bauer през 1950 г. предостави наистина убедителни доказателства. Те свързват по хирургичен път кръвоносните системи на два живи плъха, поставяйки единия в хипоксична среда, а другия да диша нормален въздух. В резултат и двете мишки произвеждат огромни количества червени кръвни клетки. Няма съмнение, че в кръвта има хормон, който стимулира производството на червени кръвни клетки, от което EPO получава името си. От друга страна, EPO е много чувствителен към хипоксия.

Каква молекула е EPO? На американския учен Голдуасер му отне 30 години, за да изясни проблема най-накрая на биохимично ниво. Ако работникът иска да върши добре работата си, първо трябва да наточи инструментите си. Функцията на EPO е да стимулира нови червени кръвни клетки, ноброят на последното не е точен. Най-важната функционална молекула в червените кръвни клетки е хемоглобинът, съдържащ хем, който съдържа железен йон в центъра си. Така екипът на Goldwasser маркира новородените червени кръвни клетки с радиоактивни изотопи на желязото и разработи чувствителен метод за откриване на активността на EPO. Това прави възможно изолирането и пречистването на много ниски концентрации на EPO (нанограми на милилитър) от проби от животински течности. Но изолирането на EPO беше изключително трудно. Те преминаха от бъбречна към анемична овча плазма, към урина на пациенти с тежък дефицит на желязо поради инфекция с анкилостома и накрая, през 1977 г., пречистиха 8 милиграма човешки EPO протеин от 2550 литра урина от японски пациенти с апластична анемия.

През 1985 г. протеиновото секвениране и генното клониране на човешки ЕРО бяха завършени. ЕРО генът кодира полипептид със 193 амино остатъка, който се превръща в зрял протеин, съставен от 166 аминокиселинни остатъка, след като сигналният пептид е отрязан по време на секрецията, и съдържа 4 места за модификация на гликозилиране. През 1998 г. бяха анализирани структурата на ЯМР разтвора на ЕРО и кристалната структура на ЕРО и неговия рецепторен комплекс. В този момент хората имат най-интуитивното разбиране за EPO.

Досега лечението на анемия обикновено изискваше кръвопреливане за попълване на дефицита на червени кръвни клетки. Тъй като хората научават повече за EPO, инжектирането му за стимулиране на производството на червени кръвни клетки в собствения им костен мозък улеснява проблема. Но пречистването на EPO директно от телесни течности, както Goldwasser направи, е трудно и добивите са ниски. Определянето на ЕРО протеин и генна последователност направи възможно производството на рекомбинантен човешки ЕРО в големи количества.

Това е направено от биотехнологична компания, наречена Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen е основана през 1980 г. само със седем члена, надявайки се да произвежда биофармацевтични продукти с нововъзникващите тогава техники на молекулярната биология. Интерферон, освобождаващ фактор на растежен хормон, ваксина срещу хепатит B, епидермален растежен фактор бяха сред горещите имена в списъка им с цели, но нито един от тези опити не успя. До 1985 г. Лин Фукун, китайски учен от Тайван, Китай, клонира гена на човешкия ЕРО и след това реализира производството на синтетичен ЕРО, използвайки технология за рекомбинация на ДНК.

Рекомбинантният човешки ЕРО има същата последователност като ендогенния ЕРО протеин и също има подобна модификация на гликозилиране. Естествено, рекомбинантният човешки ЕРО също има активността на ендогенния ЕРО. През юни 1989 г. първият продукт на Amgen, рекомбинантен човешки еритропоетин Epogen, беше одобрен от FDA на САЩ за лечение на анемия, причинена от хронична бъбречна недостатъчност и анемия при лечението на HIV инфекция. Продажбите на Epogen надхвърлиха 16 милиона долара само за три месеца. През следващите две десетилетия Amgen доминира на пазара за повторно сглобени човешки EPO. Epogen донесе на Amgen 2,5 милиарда долара приходи само през 2010 г. През 2018 г. стойността на фондовия пазар на Amgen беше 128,8 милиарда долара, което я прави осмата по големина фармацевтична компания в света.

Струва си да се отбележи, че Amgen първоначално работи с Goldwasser, за да осигури пречистени човешки ЕРО протеини за секвениране, но Goldwasser и Amgen скоро се разпаднаха поради идеологически различия. Goldwasser и неговият университет в Чикаго, които направиха фундаментални изследвания, никога не се сетиха да патентоват открития от него хормон и така не получиха нито стотинка за огромния търговски успех на EPO.

Това -- как е стимулант

Когато дишаме, кислородът навлиза в митохондриите на клетките, за да задвижи дихателната верига и да произведе огромни количества АТФ, основният източник на енергия в телата ни. Хората с анемия нямат достатъчно здрави червени кръвни клетки и най-незабавният ефект е, че не приемат достатъчно кислород, което ги кара да се чувстват уморени, подобно на проблеми с дишането по време на дълго бягане. Когато се инжектира с рекомбинантен човешки ЕРО, телата на пациентите с анемия произвеждат повече червени кръвни клетки,пренасят повече кислород и произвеждат повече от енергийната молекула АТФ, ефективно облекчавайки симптомите.

Въпреки това, някои спортни работници също започнаха да мислят за рекомбинантен човешки EPO. Ако изкуственият рекомбинантен хормон от тип EPO се използва за стимулиране на тялото на спортистите да произвежда повече червени кръвни клетки, е възможно да се подобри способността на спортистите да получават кислород и да произвеждат енергийни молекули, което също може да подобри представянето на спортистите в издръжливостта събития като колоездене, бягане на дълги разстояния и ски бягане. Статия от 1980 г. в Journal of Applied Physiology показва, че кръвните стимуланти (еритропоетин, изкуствени носители на кислород и кръвопреливане) могат да увеличат издръжливостта с 34 процента. Ако атлетите използват EPO, те могат да пробягат 8 километра на бягащата пътека за 44 секунди по-малко време от преди. Всъщност колоезденето и маратоните са най-лошите нарушители за EPO стимулантите. По време на Тур дьо Франс през 1998 г. лекар на испанския отбор на отбора на Фестина беше арестуван на френската граница с 400 бутилки изкуствен рекомбинантен EPO! Резултатът, разбира се, беше, че целият отбор беше изгонен от Турнето и забранен.

Международният олимпийски комитет добави EPO към своя забранен списък на Игрите в Барселона през 1992 г., но реорганизирането на тестването на EPO при хора беше толкова трудно, че преди Игрите през 2000 г. нямаше начин да се установи ефективно дали спортистите го използват. Има няколко причини: 1) съдържанието на EPO в телесните течности е много ниско, а EPO на ml кръв при нормални хора е около 130-230 нанограма; 2) Аминокиселинният състав на изкуствения рекомбинантен ЕРО е точно същият като този на човешкия ендогенен ЕРО протеин, само формата на гликозилиране е много малко по-различна; 3) Полуживотът на EPO в кръвта е само 5-6 часа и обикновено е неоткриваем 4-7 дни след последната инжекция; 4) Индивидуалното ниво на EPO е много различно, така че е трудно да се установи абсолютен количествен стандарт.

От 2000 г. WADA използва изследване на урината като единствен научен метод за проверка за директно откриване на рекомбинантен ЕРО. Поради леките разлики между гликоилираната форма на изкуствения рекомбинантен ЕРО и този на човешкия ЕРО, заредените свойства на двете молекули са много малки и могат да бъдат разграничени чрез метод на електрофореза, наречен изоелектрично фокусиране, което е основната стратегия за директно откриване на изкуствения рекомбинантен ЕРО. Въпреки това, някои рекомбинантни ЕРО, експресирани от човешки клетки, не показват разлика в гликозилирането, така че някои експерти предполагат, че екзогенният ЕРО и ендогенният ЕРО трябва да се различават по различно съдържание на въглероден изотоп.

Всъщност все още има ограничения в различните методи за тестване на EPO. Например Ланс Армстронг, американската легенда в колоезденето, призна, че е приемал EPO и други стимуланти по време на седемте си победи в Тур дьо Франс, но всъщност не е бил потвърден положителен за EPO в нито един допинг тест по това време. Все още трябва да изчакаме и да видим дали е "един крак по-висок" или "един фут по-висок".

Как се прави Нобелова награда

Последна дума за връзката между EPO и Нобеловата награда за физиология или медицина за 2019 г.

EPO е най-типичният случай на възприятие и реакция на човешкото тяло към хипоксия. Ето защо Семенца и Ратклиф, двама Нобелови лауреати, избраха EPO като отправна точка за изследване на механизма на клетъчното възприемане и адаптиране към хипоксия. Първата стъпка беше да се намерят елементите на EPO гена, които могат да реагират на промените в кислорода. Semenza идентифицира ключова 256-базова некодираща последователност в 3' края надолу по веригата на гена, кодиращ ЕРО, наречена елемент на отговор на хипоксия. Ако тази елементна последователност е мутирала или изтрита, способността на ЕРО протеина да реагира на хипоксия е значително намалена. Ако тази елементна последователност е слята към низходящия 3' край на други гени, които не са свързани с хипоксия, тези модифицирани гени също показват EPO-подобно активиранев условията на хипоксия.

След това Ратклиф и неговият екип откриха, че този елемент на хипоксичен отговор присъства не само в бъбречните или чернодробните клетки, отговорни за производството на ЕРО, но и в много други видове клетки, които могат да функционират при хипоксични условия. С други думи, този отговор на хипоксия може да не е специфичен за ЕРО, а по-скоро по-широко разпространено явление в клетките. Тези други клетки, които не са отговорни за производството на EPO, трябва да съдържат молекули (като транскрипционни фактори, отговорни за включване на генната експресия), които усещат промени в концентрацията на кислород и се свързват с елементи на хипоксичен отговор, за да включат гени като EPO.