Els tres guanyadors del Premi Nobel de Fisiologia o Medicina 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza i Sir Peter J. Ratcliffe ja havien guanyat el Premi Lasker de Medicina Bàsica 2016 pel seu treball sobre com les cèl·lules senten i s'adapten. a la hipòxia, així que no va ser especialment sorprenent. Van descobrir i identificar la molècula clau del factor 1 induïble per la hipòxia (HIF-1). Avui volem tornar a l'origen de l'estudi, que és l'eritropoietina, o EPO, una molècula miraculosa.
És el factor més important en la producció de glòbuls vermells
Els glòbuls vermells són el tipus de cèl·lules sanguínies més abundants a la sang, i són el principal mitjà per transportar l'oxigen i el diòxid de carboni a través de la sang dels vertebrats. Els eritròcits es generen a la medul·la òssia: les cèl·lules mare hematopoietiques primer proliferen i es diferencien en progenitors de diverses cèl·lules sanguínies, i els progenitors eritroides poden diferenciar-se i madurar encara més en eritròcits. En condicions normals, la taxa de producció d'eritròcits humans és molt baixa, però sota estrès com ara sagnat, hemòlisi i hipòxia, la taxa de producció d'eritròcits es pot augmentar fins a vuit vegades. En aquest procés, l'eritropoietina EPO és un dels factors més importants.
L'EPO és una hormona sintetitzada principalment al ronyó. La seva naturalesa química és una proteïna altament glicosilada. Per què als ronyons? Aproximadament un litre de sang flueix pels ronyons cada minut, de manera que poden detectar de manera ràpida i eficient els canvis en els nivells d'oxigen a la sang. Quan els nivells d'oxigen a la sang són baixos, els ronyons responen ràpidament i produeixen grans quantitats d'EPO. Aquest últim circula pel torrent sanguini fins a la medul·la òssia, on afavoreix la conversió de cèl·lules progenitores eritroides en glòbuls vermells. Els glòbuls vermells madurs s'alliberen de la medul·la òssia al sistema circulatori per millorar la capacitat del cos d'unir-se a l'oxigen. Quan els ronyons senten un augment d'oxigen a la sang, redueixen la producció d'EPO, que al seu torn redueix la quantitat de glòbuls vermells a la medul·la òssia.
Això fa un bucle d'ajust perfecte. Tanmateix, les persones que viuen a gran altitud i alguns pacients amb anèmia sovint es troben amb la condició de nivell d'oxigen en sang contínuament baix, que no pot completar la circulació anterior i estimular el ronyó per secretar contínuament EPO, de manera que la concentració d'EPO en sang és més alta que la gent normal.
Van trigar gairebé 80 anys a descobrir-ho
Com molts descobriments importants, la comprensió de l'EPO per part dels científics no ha estat fàcil, amb preguntes i reptes al llarg del camí. Van passar prop de 80 anys des del concepte d'EPO fins a la determinació final de la molècula específica.
El 1906, els científics francesos Carnot i Deflandre van injectar a conills normals sèrum de conills anèmics i van trobar que el recompte de glòbuls vermells en el plasma de conills normals augmentava. Creien que alguns factors humorals del plasma podrien estimular i regular la producció de glòbuls vermells. Aquest va ser el primer prototip de concepte EPO. Malauradament, els resultats no s'han replicat en les dècades posteriors, principalment perquè el recompte de nous glòbuls vermells no era precís.
L'experiment de parabiosi de Reissmann i Ruhenstroth-Bauer el 1950 va proporcionar una evidència molt forta. Van enllaçar quirúrgicament els sistemes circulatoris de dues rates vives, col·locant una en un ambient hipòxic i l'altra respirant aire normal. Com a resultat, ambdós ratolins van produir quantitats massives de glòbuls vermells. No hi ha dubte que hi ha una hormona al torrent sanguini que estimula la producció de glòbuls vermells, de la qual l'EPO rep el seu nom. D'altra banda, l'EPO és molt sensible a la hipòxia.
Quina molècula és l'EPO? El científic nord-americà Goldwasser va trigar 30 anys a aclarir finalment el problema a nivell bioquímic. Si un treballador vol fer una bona feina, primer ha d'esmolar les seves eines. La funció de l'EPO és estimular nous glòbuls vermells, peròel recompte d'aquest últim no és exacte. La molècula funcional més important dels glòbuls vermells és l'hemo que conté hemoglobina, que conté un ió ferros al seu centre. Així, l'equip de Goldwasser va etiquetar els glòbuls vermells nounats amb isòtops de ferro radioactiu i va desenvolupar un mètode sensible per detectar l'activitat de l'EPO. Això fa possible aïllar i purificar concentracions molt baixes d'EPO (nanogrames per mil·lilitre) a partir de mostres de fluids animals. Però l'aïllament de l'EPO va ser extremadament difícil. Van passar del ronyó al plasma anèmic d'ovella, a l'orina de pacients amb deficiència de ferro greu a causa d'una infecció per anquilostomia i, finalment, el 1977, van purificar 8 mil·ligrams de proteïna EPO humana de 2.550 litres d'orina de pacients japonesos amb anèmia aplàstica.
El 1985, es van completar la seqüenciació de proteïnes i la clonació gènica de l'EPO humana. El gen EPO codifica un polipèptid amb 193 residus amino, que es converteix en una proteïna madura composta per 166 residus d'aminoàcids després que el pèptid senyal es retalla durant la secreció i conté 4 llocs per a la modificació de la glicosilació. El 1998, es va analitzar l'estructura de solució de RMN de l'EPO i l'estructura cristal·lina de l'EPO i el seu complex receptor. En aquest punt, la gent té la comprensió més intuïtiva de l'EPO.
Fins ara, el tractament de l'anèmia sol requerir transfusions de sang per reposar la deficiència de glòbuls vermells. A mesura que la gent aprèn més sobre l'EPO, injectar-la per estimular la producció de glòbuls vermells a la seva pròpia medul·la òssia ha facilitat el problema. Però purificar l'EPO directament dels fluids corporals, com va fer Goldwasser, és difícil i els rendiments són baixos. La determinació de la proteïna EPO i la seqüència gènica va permetre produir EPO humana recombinant en grans quantitats.
Ho va fer una empresa de biotecnologia anomenada Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen es va fundar l'any 1980 amb només set membres, amb l'esperança de fabricar productes biofarmacèutics amb les tècniques emergents de la biologia molecular. L'interferó, el factor alliberador de l'hormona del creixement, la vacuna contra l'hepatitis B i el factor de creixement epidèrmic es trobaven entre els noms més populars de la seva llista d'objectius, però cap d'aquests intents va tenir èxit. Fins a 1985, Lin Fukun, un científic xinès de Taiwan, Xina, va clonar el gen de l'EPO humana i després es va adonar de la producció d'EPO sintètica mitjançant la tecnologia de recombinació d'ADN.
L'EPO humana recombinant té la mateixa seqüència que la proteïna EPO endògena i també té una modificació de la glicosilació similar. Naturalment, l'EPO humana recombinant també té l'activitat de l'EPO endògena. El juny de 1989, el primer producte d'Amgen, l'eritropoietina humana recombinant Epogen, va ser aprovat per la FDA dels EUA per al tractament de l'anèmia causada per insuficiència renal crònica i l'anèmia en el tractament de la infecció pel VIH. Les vendes d'Epogen van superar els 16 milions de dòlars en només tres mesos. Durant les dues dècades següents, Amgen va dominar el mercat de l'EPO humana remuntada. Epogen va aportar a Amgen 2.500 milions de dòlars en ingressos només el 2010. El 2018, el valor de borsa d'Amgen va ser de 128.800 milions de dòlars, cosa que la converteix en la vuitena companyia farmacèutica més gran del món.
Val la pena assenyalar que Amgen va treballar inicialment amb Goldwasser per proporcionar proteïnes EPO humanes purificades per a la seqüenciació, però Goldwasser i Amgen aviat van caure a causa de diferències ideològiques. Goldwasser i la seva Universitat de Chicago, que va fer investigacions bàsiques, mai van pensar en patentar l'hormona que va descobrir, i per tant no han rebut ni un cèntim per l'enorme èxit comercial de l'EPO.
Com és un estimulant
Quan respirem, l'oxigen entra als mitocondris de les cèl·lules per impulsar la cadena respiratòria i produir quantitats massives d'ATP, la principal font d'energia del nostre cos. Les persones anèmiques no tenen prou glòbuls vermells sans, i l'efecte més immediat és que no prenen prou oxigen, la qual cosa els fa sentir cansats, com els problemes respiratoris durant un llarg període. Quan s'injecta amb EPO humana recombinant, els cossos dels pacients amb anèmia produeixen més glòbuls vermells,transporten més oxigen i produeixen més molècula d'energia ATP, alleujant eficaçment els símptomes.
Tanmateix, alguns treballadors esportius també han començat a pensar en l'EPO humana recombinant. Si l'hormona recombinant artificial de tipus EPO s'utilitza per estimular el cos dels atletes a produir més glòbuls vermells, és possible millorar la capacitat dels atletes per obtenir oxigen i produir molècules d'energia, la qual cosa també pot millorar el rendiment dels atletes en resistència. esdeveniments com el ciclisme, la cursa de llarga distància i l'esquí de fons. Un article de 1980 al Journal of Applied Physiology va demostrar que els estimulants de la sang (eritropoietina, portadors artificials d'oxigen i transfusions de sang) poden augmentar la resistència en un 34 per cent. Si els atletes utilitzen l'EPO, poden córrer 8 quilòmetres a la cinta en 44 segons menys que abans. De fet, el ciclisme i les maratons han estat els pitjors delinqüents dels estimulants de l'EPO. Durant el Tour de França de 1998, un metge de l'equip espanyol de l'equip Festina va ser detingut a la frontera francesa amb 400 ampolles d'EPO recombinant artificial! El resultat, és clar, va ser que tot l'equip va ser expulsat del Tour i sancionat.
El Comitè Olímpic Internacional va afegir EPO a la seva llista prohibida als Jocs de Barcelona de 1992, però reorganitzar les proves d'EPO humana va ser tan difícil que abans dels Jocs del 2000 no hi havia manera de detectar eficaçment si els atletes l'estaven utilitzant. Hi ha diverses raons: 1) El contingut d'EPO en els fluids corporals és molt baix, i l'EPO per ml de sang en persones normals és d'uns 130-230 nanograms; 2) La composició d'aminoàcids de l'EPO recombinant artificial és exactament la mateixa que la de la proteïna EPO endògena humana, només la forma de glicosilació és molt lleugerament diferent; 3) La vida mitjana de l'EPO a la sang és de només 5-6 hores i, generalment, és indetectable 4-7 dies després de l'última injecció; 4) El nivell d'EPO individual és molt diferent, per la qual cosa és difícil establir un estàndard quantitatiu absolut.
Des de l'any 2000, l'AMA ha utilitzat la prova d'orina com a únic mètode de verificació científica per a la detecció directa d'EPO recombinant. A causa de les lleugeres diferències entre la forma glicoilada de l'EPO recombinant artificial i la de l'EPO humana, les propietats carregades de les dues molècules són molt petites i es poden distingir mitjançant un mètode d'electroforesi anomenat enfocament isoelèctric, que és l'estratègia principal per a la detecció directa de l'EPO recombinant artificial. Tanmateix, algunes EPO recombinants expressades per cèl·lules derivades humanes no van mostrar cap diferència en la glicosilació, de manera que alguns experts van suggerir que l'EPO exògena i l'EPO endògena haurien de distingir-se per un contingut d'isòtops de carboni diferent.
De fet, encara hi ha limitacions en els diferents mètodes de prova de l'EPO. Per exemple, Lance Armstrong, la llegenda del ciclisme nord-americà, va admetre haver pres EPO i altres estimulants durant les seves set victòries al Tour de França, però en realitat no va ser confirmat positiu per EPO en cap prova de dopatge en aquell moment. Encara hem d'esperar i veure si està "un peu més amunt" o "un peu més amunt".
Com es fa un premi Nobel
Una darrera paraula sobre la connexió entre l'EPO i el Premi Nobel de Fisiologia o Medicina 2019.
L'EPO és el cas més típic de percepció i resposta del cos humà a la hipòxia. Per això, Semenza i Ratcliffe, dos premis Nobel, van escollir l'EPO com a punt de partida per estudiar el mecanisme de percepció cel·lular i adaptació a la hipòxia. El primer pas va ser trobar els elements del gen EPO que poguessin respondre als canvis d'oxigen. Semenza va identificar una seqüència clau no codificant de 256 bases a l'extrem 3 'avall del gen que codifica EPO, anomenada element de resposta a la hipòxia. Si aquesta seqüència d'elements es muta o s'elimina, la capacitat de la proteïna EPO de respondre a la hipòxia es redueix molt. Si aquesta seqüència d'elements es fusiona a l'extrem 3' aigües avall d'altres gens no associats a la hipòxia, aquests gens modificats també mostren una activació semblant a l'EPO.en condicions d'hipòxia.
Ratcliffe i el seu equip van descobrir llavors que aquest element de resposta hipòxica no només està present a les cèl·lules renals o hepàtiques responsables de la producció d'EPO, sinó també en molts altres tipus de cèl·lules que poden funcionar en condicions hipòxiques. En altres paraules, aquesta resposta a la hipòxia pot no ser específica de l'EPO, sinó un fenomen més estès a les cèl·lules. Aquestes altres cèl·lules, que no són responsables de la producció d'EPO, han de contenir molècules (com els factors de transcripció responsables d'activar l'expressió gènica) que detectin els canvis en la concentració d'oxigen i s'uneixin a elements de resposta hipòxica per activar gens com l'EPO.
