I trè vincitori di u Premiu Nobel 2019 in Fisiologia o Medicina, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza è Sir Peter J. Ratcliffe avianu digià vintu u Premiu Lasker 2016 in Medicina Basica per u so travagliu nantu à cumu si sentenu è si adattanu e cellule. à l'ipoxia, cusì ùn era micca particularmente surprisante. Anu scupertu è identificatu u fattore 1 di l'ipoxia-inducible molecule chjave (HIF-1). Oghje vulemu vultà à l'urìgine di u studiu, chì hè l'eritropoietina, o EPO, una molècula miraculosa.

Hè u fattore più impurtante in a produzzione di globuli rossi

I globuli rossi sò u tipu più abbundante di cellule di sangue in u sangue, è sò u mediu principale per u trasportu di l'ossigenu è di diossidu di carbonu per u sangue di i vertebrati. L'eritrociti sò generati in a medula ossea: e cellule staminali hematopoietiche prima proliferanu è si differenzianu in progenitori di diverse cellule di sangue, è i progenitori eritroidi ponu più differenziate è mature in eritrociti. In cundizioni nurmali, u tassu di produzzione di eritrociti umani hè assai bassu, ma sottu u stress cum'è l'hemorragia, l'emolisi è l'ipoxia, u tassu di produzzione di eritrociti pò esse aumentatu finu à ottu volte. In questu prucessu, l'eritropoietina EPO hè unu di i fatturi più impurtanti.

L'EPO hè una hormona sintetizzata principalmente in u rino. A so natura chimica hè una proteina altamente glicosilata. Perchè in i rini? Circa un litru di sangue passa per i rini ogni minutu, cusì ponu detectà rapidamente è efficacemente cambiamenti in i livelli di l'ossigenu in u sangue. Quandu i livelli di l'ossigenu in u sangue sò bassu, i rini rispundenu rapidamente è pruducenu quantità grande di EPO. L'ultime circula à traversu u sangue à a medula di l'osse, induve prumove a cunversione di e cellule progenitrici eritroide in globuli rossi. I globuli rossi maturi sò liberati da a medula di l'osse in u sistema circulatori per migliurà a capacità di u corpu à ligà à l'ossigenu. Quandu i rini sentu un aumentu di l'ossigenu in u sangue, reducenu a produzzione di EPO, chì à u turnu reduce a quantità di globuli rossi in a medula ossea.

Questu fa un ciclu di regulazione perfetta. In ogni casu, e persone chì vivenu à l'altitudine alta è certi malati di l'anemia spessu scontranu a cundizione di u nivellu di l'ossigenu di sangue in continuu bassu, chì ùn pò micca cumplettà a circulazione sopra è stimulà u rino per secrete continuamente EPO, perchè a cuncentrazione di EPO di sangue hè più altu ch'è e persone ordinarie.

Ci hà pigliatu quasi 80 anni per scopre

Cum'è parechje scuperte maiò, a cunniscenza di l'EPO da i scientisti ùn hè micca stata liscia, cù dumande è sfide in a strada. Ci hà pigliatu quasi 80 anni da u cuncettu di EPO à a determinazione finale di a molecula specifica.

In u 1906, i scentifichi francesi Carnot è Deflandre injected cuniglii nurmali cù u serum di cunigli anemic è truvaru chì u numeru di globuli rossi in u plasma di cunigli nurmali cresce. Cridianu chì certi fatturi umorali in u plasma puderanu stimulà è regulà a produzzione di globuli rossi. Questu hè u primu prototipu di cuncettu EPO. Sfurtunatamente, i risultati ùn sò micca stati replicati in i decennii successivi, soprattuttu perchè u cuntu di i novi globuli rossi ùn era micca precisu.

L'esperimentu di parabiosi di Reissmann è Ruhenstroth-Bauer in u 1950 furnia evidenza veramente forte. Anu ligatu chirurgicamente i sistemi circulatori di dui rati viventi, pusendu unu in un ambiente ipoxicu è l'altru respira l'aria normale. In u risultatu, i dui topi pruducianu quantità massive di globuli rossi. Ùn ci hè micca dubbitu chì ci hè una hormona in u sangue chì stimula a produzzione di globuli rossi, da quale EPO riceve u so nome. Per d 'altra banda, l'EPO hè assai sensibile à l'ipoxia.

Chì molécula hè EPO? Ci pigliò u scientist americanu Goldwasser 30 anni per chjarificà infine u prublema à u livellu biochimicu. Se un travagliadore vole fà un bonu travagliu, deve prima affila i so arnesi. A funzione di EPO hè di stimulà novi globuli rossi, mau cuntu di l'ultimi ùn hè micca precisu. A molècula funziunale più impurtante in i globuli rossi hè l'emoglobina chì cuntene heme, chì cuntene un ion ferrosu in u so centru. Allora a squadra di Goldwasser hà etichettatu i globuli rossi di u sangue cù isotopi di ferru radiuattivu è hà sviluppatu un metudu sensitivu per a rilevazione di l'attività EPO. Questu permette di isolà è purificà cuncintrazioni assai bassu di EPO (nanogrammi per millilitre) da campioni di fluidi animali. Mais l'isolement de l'EPO était extrêmement difficile. Anu cambiatu da u reni à u plasma di pecura anemica, à l'urina di i malati cù una carenza di ferru severa per via di l'infezzione da anchilostoma, è infine, in u 1977, purificò 8 milligrammi di proteina EPO umana da 2.550 litri d'urina da i pazienti giapponesi cun anemia aplastica.

In u 1985, a sequenza di a proteina è a clonazione di geni di l'EPO umanu sò stati cumpletati. U genu EPO codifica un polipeptide cù 193 amino residues, chì diventa una proteina matura composta da 166 residues aminoacidu dopu chì u peptide signale hè clippatu durante a secrezione, è cuntene 4 siti per a mudificazione di glicosilazione. In u 1998, a struttura di suluzione RMN di l'EPO è a struttura cristallina di l'EPO è u so complexu di u receptore sò stati analizati. À questu puntu, a ghjente hà a cunniscenza più intuitiva di EPO.

Finu à avà, u trattamentu per l'anemia generalmente necessitava trasfusioni di sangue per rinfurzà a carenza di i globuli rossi. Quandu a ghjente ampara più nantu à EPO, l'injecting per stimulà a produzzione di globuli rossi in a so propria medula ossea hà facilitatu u prublema. Ma purificà l'EPO direttamente da i fluidi di u corpu, cum'è Goldwasser hà fattu, hè difficiule è i rendimenti sò bassi. A determinazione di a proteina EPO è a sequenza di geni hà permessu di pruduce EPO umanu recombinante in grande quantità.

Hè stata fatta da una cumpagnia di biotecnologia chjamata Genetica Molecular Applied (Amgen). Amgen hè stata fundata in u 1980 cù solu sette membri, sperendu di fà biofarmaceutica cù e tecniche emergenti di a biologia moleculare. L'interferon, u fattore di liberazione di l'hormone di crescita, a vacuna di l'hepatitis B, u fattore di crescita epidermali eranu trà i nomi caldi in a so lista di mira, ma nimu di sti tentativi hà successu. Finu à u 1985, Lin Fukun, un scientist Chinese di Taiwan, Cina, clonava u genu di l'EPO umanu, è dopu hà realizatu a produzzione di EPO sinteticu cù a tecnulugia di recombinazione di DNA.

L'EPO umanu recombinante hà a listessa sequenza di a proteina EPO endogena, è hà ancu una mudificazione di glicosilazione simili. Naturalmente, l'EPO umanu recombinante hà ancu l'attività di EPO endogena. In u ghjugnu di u 1989, u primu pruduttu di Amgen, l'eritropoietina umana recombinante Epogen, hè stata appruvata da a FDA di i Stati Uniti per u trattamentu di l'anemia causata da insufficienza renale cronica è anemia in u trattamentu di l'infezzione HIV. A vendita di Epogen hà righjuntu $ 16 milioni in solu trè mesi. In i dui decennii successivi, Amgen hà duminatu u mercatu per l'EPO umanu riassemblatu. Epogen hà purtatu à Amgen $ 2,5 miliardi in entrate solu in 2010. In 2018, u valore di a borsa di Amgen era $ 128,8 miliardi, facendu a ottava più grande cumpagnia farmaceutica in u mondu.

Vale a pena nutà chì Amgen hà inizialmente travagliatu cù Goldwasser per furnisce e proteine ​​​​EPO umane purificate per a sequenza, ma Goldwasser è Amgen sò prestu caduti per differenzi ideologichi. Goldwasser è a so Università di Chicago, chì hà fattu a ricerca basica, ùn anu mai pensatu di patentà l'hormone chì hà scupertu, è cusì ùn anu micca ricevutu un centesimu per u successu cummerciale enormi di EPO.

Hè - cumu hè un stimulante

Quandu si respira, l'ossigenu entra in a mitocondria di e cellule per guidà a catena respiratoria è pruduce quantità massive di ATP, a fonte principale di energia in i nostri corpi. E persone anemiche ùn anu micca abbastanza globuli rossi sani, è l'effettu più immediatu hè chì ùn piglianu micca abbastanza ossigenu, chì li face sentu stanchi, simili à i prublemi di respirazione durante una longa corsa. Quandu sò iniettati cù EPO umanu recombinante, i corpi di i malati di l'anemia producenu più globuli rossi,porta più ossigenu, è pruduce più di a molècula energetica ATP, effittivamenti allevià i sintomi.

Tuttavia, certi travagliadori sportivi anu ancu cuminciatu à pensà à l'EPO umanu recombinante. Se l'hormone artificiale recombinante di tipu EPO hè aduprata per stimulà u corpu di l'atleti per pruduce più globuli rossi, hè pussibule migliurà a capacità di l'atleti per ottene l'ossigenu è pruduce molécule d'energia, chì ponu ancu migliurà u rendiment di l'atleti in resistenza. manifestazioni cum'è u ciclismo, a corsa di longa distanza è u sci di fondo. Un documentu di u 1980 in u Journal of Applied Physiology hà dimustratu chì i stimulanti di sangue (eritropoietina, trasportatori d'ossigenu artificiale è trasfusioni di sangue) ponu aumentà a resistenza di 34 per centu. Se l'atleti utilizanu l'EPO, ponu curriri 8 chilometri nantu à u treadmill in 44 seconde di menu tempu chè prima. In fattu, u ciclismu è i maratoni sò stati i peghju delinquenti per i stimulanti EPO. Duranti u Tour de France 1998, un duttore di a squadra spagnola per a squadra Festina hè statu arrestatu à a fruntiera francese cù 400 buttigli di EPO recombinante artificiale ! U risultatu, sicuru, era chì tutta a squadra hè stata cacciata da u Tour è pruibita.

U Cumitatu Olimpicu Internaziunale hà aghjustatu l'EPO à a so lista pruibita in i Ghjochi di Barcellona di u 1992, ma riurganizà e teste di l'EPO umanu era cusì difficiule chì prima di i Ghjochi di u 2000 ùn ci era manera di detectà efficacemente se l'atleti l'utilizanu. Ci hè parechje ragioni: 1) U cuntenutu di EPO in i fluidi di u corpu hè assai bassu, è l'EPO per ml di sangue in a ghjente normale hè di circa 130-230 nanogrammi; 2) A cumpusizioni di aminoacidu di l'EPO recombinante artificiale hè esattamente u listessu cum'è quella di a proteina EPO endogena umana, solu a forma di glycosylation hè assai ligeramente diversa; 3) L'emivita di l'EPO in u sangue hè solu 5-6 ore, è hè generalmente indetectable 4-7 ghjorni dopu l'ultima iniezione; 4) U livellu individuale EPO hè assai diversu, cusì hè difficiule di stabilisce un standard quantitatiu assolutu.

Dapoi u 2000, l'AMA hà utilizatu a prova d'urina cum'è l'unicu metudu di verificazione scientifica per a rilevazione diretta di EPO recombinante. A causa di e ligere differenze trà a forma glicoilata di l'EPO recombinante artificiale è quella di l'EPO umanu, e proprietà cariche di e duie molécule sò assai chjuche è ponu esse distinti da un metudu elettroforesi chjamatu focusing isoelettricu, chì hè a strategia principale per u rilevazione diretta di EPO recombinante artificiale. Toutefois, certains EPO recombinants exprimés par des cellules dérivées humaines n'ont montré aucune différence dans la glycosylation, donc certains experts ont suggéré que l'EPO exogène et l'EPO endogène devraient être distingués par une teneur différente en isotopes de carbone.

In fatti, ci sò sempre limitazioni in diversi metudi di teste per EPO. Per esempiu, Lance Armstrong, a legenda di u ciclismu americanu, hà ammissu per piglià EPO è altri stimulanti durante e so sette vittorie di u Tour de France, ma ùn era micca veramente cunfirmatu pusitivu per EPO in alcuna prova di doping à quellu tempu. Avemu sempre à aspittà è vede s'ellu hè "un pede più altu" o "un pede più altu".

Cumu fà un Premiu Nobel

Una ultima parolla nantu à a cunnessione trà EPO è u Premiu Nobel 2019 in Fisiologia o Medicina.

EPO hè u casu più tipicu di a percepzione di u corpu umanu è a risposta à l'ipoxia. Dunque, Semenza è Ratcliffe, dui premiati Nobel, anu sceltu l'EPO cum'è u puntu di partenza per studià u mecanismu di a percepzione cellulare è l'adattazione à l'ipoxia. U primu passu era di truvà l'elementi di u genu EPO chì puderanu risponde à i cambiamenti di l'ossigenu. Semenza hà identificatu una sequenza chjave non codificante di 256 basi à l'estremità 3' downstream di u gene codificante EPO, chjamatu l'elementu di risposta di l'ipoxia. Se sta sequenza di l'elementu hè mutata o eliminata, a capacità di a proteina EPO per risponde à l'ipoxia hè assai ridutta. Se sta sequenza di l'elementu hè fusionata à l'estremità 3' downstream di altri geni chì ùn sò micca assuciati cù l'ipoxia, sti geni mudificati mostranu ancu attivazione simile à EPO.in cundizioni di ipoxia.

Ratcliffe è u so squadra anu scupertu chì questu elementu di risposta ipoxica ùn hè micca solu presente in e cellule renali o di u fegatu rispunsevuli di a produzzione di EPO, ma ancu in parechje altre tippi di cellule chì ponu funziunà in cundizioni ipossiche. In altri palori, sta risposta à l'ipoxia pò esse micca specificu à EPO, ma piuttostu un fenomenu più diffusa in e cellule. Queste altre cellule, chì ùn sò micca rispunsevuli di a produzzione di EPO, devenu cuntenenu molécule (cum'è i fatturi di trascrizione rispunsevuli di accende l'espressione genica) chì sentu cambiamenti in a cuncentrazione di l'ossigenu è si liganu à l'elementi di risposta ipoxica per attivà i geni cum'è l'EPO.