Οι τρεις νικητές του Βραβείου Νόμπελ Φυσιολογίας ή Ιατρικής 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza και Sir Peter J. Ratcliffe είχαν ήδη κερδίσει το βραβείο Lasker 2016 στη Βασική Ιατρική για την εργασία τους σχετικά με το πώς τα κύτταρα αντιλαμβάνονται και προσαρμόζονται στην υποξία, οπότε δεν ήταν ιδιαίτερα περίεργο. Ανακάλυψαν και αναγνώρισαν το βασικό μόριο που επάγεται από την υποξία παράγοντα 1 (HIF-1). Σήμερα θέλουμε να επιστρέψουμε στην προέλευση της μελέτης, που είναι η ερυθροποιητίνη, ή EPO, ένα θαυματουργό μόριο.

Είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας στην παραγωγή ερυθρών αιμοσφαιρίων

Τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι ο πιο άφθονος τύπος αιμοσφαιρίων στο αίμα και είναι το κύριο μέσο για τη μεταφορά οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα μέσω του αίματος των σπονδυλωτών. Τα ερυθροκύτταρα δημιουργούνται στον μυελό των οστών: Τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα πρώτα πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται σε πρόγονους διαφόρων αιμοσφαιρίων και οι ερυθροειδείς πρόγονοι μπορούν περαιτέρω να διαφοροποιηθούν και να ωριμάσουν σε ερυθροκύτταρα. Υπό κανονικές συνθήκες, ο ρυθμός παραγωγής ανθρώπινων ερυθροκυττάρων είναι πολύ χαμηλός, αλλά υπό συνθήκες στρες όπως αιμορραγία, αιμόλυση και υποξία, ο ρυθμός παραγωγής ερυθροκυττάρων μπορεί να αυξηθεί έως και οκτώ φορές. Σε αυτή τη διαδικασία, η ερυθροποιητίνη EPO είναι ένας από τους πιο σημαντικούς παράγοντες.

Η ΕΡΟ είναι μια ορμόνη που συντίθεται κυρίως στα νεφρά. Η χημική του φύση είναι μια εξαιρετικά γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη. Γιατί στα νεφρά; Περίπου ένα λίτρο αίματος ρέει μέσω των νεφρών κάθε λεπτό, ώστε να μπορούν γρήγορα και αποτελεσματικά να ανιχνεύουν αλλαγές στα επίπεδα οξυγόνου στο αίμα. Όταν τα επίπεδα οξυγόνου στο αίμα είναι χαμηλά, τα νεφρά ανταποκρίνονται γρήγορα και παράγουν μεγάλες ποσότητες EPO. Το τελευταίο κυκλοφορεί μέσω της κυκλοφορίας του αίματος στο μυελό των οστών, όπου προωθεί τη μετατροπή των προγονικών κυττάρων του ερυθροειδούς σε ερυθρά αιμοσφαίρια. Τα ώριμα ερυθρά αιμοσφαίρια απελευθερώνονται από τον μυελό των οστών στο κυκλοφορικό σύστημα για να βελτιώσουν την ικανότητα του σώματος να δεσμεύεται με το οξυγόνο. Όταν τα νεφρά αισθάνονται αύξηση του οξυγόνου στο αίμα, μειώνουν την παραγωγή EPO, η οποία με τη σειρά της μειώνει την ποσότητα των ερυθρών αιμοσφαιρίων στο μυελό των οστών.

Αυτό δημιουργεί έναν τέλειο βρόχο προσαρμογής. Ωστόσο, οι άνθρωποι που ζουν σε μεγάλο υψόμετρο και ορισμένοι ασθενείς με αναιμία συχνά αντιμετωπίζουν την κατάσταση του συνεχώς χαμηλού επιπέδου οξυγόνου στο αίμα, το οποίο δεν μπορεί να ολοκληρώσει την παραπάνω κυκλοφορία και να διεγείρει το νεφρό να εκκρίνει συνεχώς EPO, έτσι ώστε η συγκέντρωση EPO στο αίμα να είναι υψηλότερη από τους απλούς ανθρώπους.

Χρειάστηκαν σχεδόν 80 χρόνια για να το αποκαλύψει

Όπως πολλές σημαντικές ανακαλύψεις, η κατανόηση των επιστημόνων για την EPO δεν ήταν ομαλή, με ερωτήματα και προκλήσεις στην πορεία. Χρειάστηκαν σχεδόν 80 χρόνια από την ιδέα της ΕΡΟ μέχρι τον τελικό προσδιορισμό του συγκεκριμένου μορίου.

Το 1906, οι Γάλλοι επιστήμονες Carnot και Deflandre έκαναν ένεση σε κανονικά κουνέλια με ορό αναιμικών κουνελιών και διαπίστωσαν ότι ο αριθμός των ερυθρών αιμοσφαιρίων στο πλάσμα των φυσιολογικών κουνελιών αυξήθηκε. Πίστευαν ότι ορισμένοι χυμικοί παράγοντες στο πλάσμα θα μπορούσαν να διεγείρουν και να ρυθμίσουν την παραγωγή ερυθρών αιμοσφαιρίων. Αυτό ήταν το πρώτο πρωτότυπο concept EPO. Δυστυχώς, τα αποτελέσματα δεν επαναλήφθηκαν τις επόμενες δεκαετίες, κυρίως επειδή ο αριθμός των νέων ερυθρών αιμοσφαιρίων δεν ήταν ακριβής.

Το πείραμα παραβίωσης των Reissmann και Ruhenstroth-Bauer το 1950 παρείχε πραγματικά ισχυρά στοιχεία. Συνέδεσαν χειρουργικά τα κυκλοφορικά συστήματα δύο ζώντων αρουραίων, τοποθετώντας τον έναν σε υποξικό περιβάλλον και τον άλλο αναπνέοντας κανονικό αέρα. Ως αποτέλεσμα, και τα δύο ποντίκια παρήγαγαν τεράστιες ποσότητες ερυθρών αιμοσφαιρίων. Δεν υπάρχει αμφιβολία ότι υπάρχει μια ορμόνη στην κυκλοφορία του αίματος που διεγείρει την παραγωγή ερυθρών αιμοσφαιρίων, από την οποία πήρε το όνομά της η ΕΡΟ. Από την άλλη πλευρά, η ΕΡΟ είναι πολύ ευαίσθητη στην υποξία.

Τι μόριο είναι η ΕΡΟ; Ο Αμερικανός επιστήμονας Goldwasser χρειάστηκε 30 χρόνια για να ξεκαθαρίσει τελικά το πρόβλημα σε βιοχημικό επίπεδο. Αν ένας εργαζόμενος θέλει να κάνει καλή δουλειά, πρέπει πρώτα να ακονίσει τα εργαλεία του. Η λειτουργία της ΕΡΟ είναι να διεγείρει νέα ερυθρά αιμοσφαίρια, αλλάη καταμέτρηση του τελευταίου δεν είναι ακριβής. Το πιο σημαντικό λειτουργικό μόριο στα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι η αίμη που περιέχει αιμοσφαιρίνη, η οποία περιέχει ένα ιόν σιδήρου στο κέντρο της. Έτσι, η ομάδα του Goldwasser επισήμανε τα νεογέννητα ερυθρά αιμοσφαίρια με ισότοπα ραδιενεργού σιδήρου και ανέπτυξε μια ευαίσθητη μέθοδο για την ανίχνευση της δραστηριότητας της EPO. Αυτό καθιστά δυνατή την απομόνωση και τον καθαρισμό πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων EPO (νανογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο) από δείγματα ζωικών υγρών. Όμως η απομόνωση της ΕΠΟ ήταν εξαιρετικά δύσκολη. Μετέτρεψαν από το πλάσμα των νεφρών σε αναιμικό πρόβειο, στα ούρα ασθενών με σοβαρή ανεπάρκεια σιδήρου λόγω μόλυνσης από αγκυλόστομα και τελικά, το 1977, καθάρισαν 8 χιλιοστόγραμμα ανθρώπινης πρωτεΐνης EPO από 2.550 λίτρα ούρων από Ιάπωνες ασθενείς με απλαστική αναιμία.

Το 1985, ολοκληρώθηκε η αλληλουχία πρωτεϊνών και η κλωνοποίηση γονιδίων της ανθρώπινης ΕΡΟ. Το γονίδιο EPO κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο με 193 υπολείμματα αμινοξέος, το οποίο γίνεται ώριμη πρωτεΐνη που αποτελείται από 166 υπολείμματα αμινοξέων αφού το πεπτίδιο-σηματοδότης κοπεί κατά την έκκριση και περιέχει 4 θέσεις για τροποποίηση γλυκοζυλίωσης. Το 1998, αναλύθηκε η δομή του διαλύματος NMR της ΕΡΟ και η κρυσταλλική δομή της ΕΡΟ και του συμπλόκου υποδοχέα της. Σε αυτό το σημείο, οι άνθρωποι έχουν την πιο διαισθητική κατανόηση της EPO.

Μέχρι τώρα, η θεραπεία για την αναιμία απαιτούσε συνήθως μεταγγίσεις αίματος για την αναπλήρωση της ανεπάρκειας των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Καθώς οι άνθρωποι μαθαίνουν περισσότερα για την EPO, η ένεση της για την τόνωση της παραγωγής ερυθρών αιμοσφαιρίων στον μυελό των οστών τους έχει κάνει το πρόβλημα ευκολότερο. Αλλά ο καθαρισμός της ΕΡΟ απευθείας από τα σωματικά υγρά, όπως έκανε η Goldwasser, είναι δύσκολος και οι αποδόσεις είναι χαμηλές. Ο προσδιορισμός της πρωτεΐνης ΕΡΟ και της γονιδιακής αλληλουχίας κατέστησε δυνατή την παραγωγή ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ΕΡΟ σε μεγάλες ποσότητες.

Έγινε από μια εταιρεία βιοτεχνολογίας που ονομάζεται Applied Molecular Genetics (Amgen). Η Amgen ιδρύθηκε το 1980 με μόλις επτά μέλη, ελπίζοντας να κατασκευάσει βιοφαρμακευτικά προϊόντα με τις τότε αναδυόμενες τεχνικές της μοριακής βιολογίας. Η ιντερφερόνη, ο παράγοντας απελευθέρωσης αυξητικής ορμόνης, το εμβόλιο ηπατίτιδας Β, ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας ήταν μεταξύ των καυτών ονομάτων στη λίστα των στόχων τους, αλλά καμία από αυτές τις προσπάθειες δεν πέτυχε. Μέχρι το 1985, ο Lin Fukun, ένας Κινέζος επιστήμονας από την Ταϊβάν της Κίνας, κλωνοποίησε το γονίδιο της ανθρώπινης EPO και στη συνέχεια πραγματοποίησε την παραγωγή συνθετικής EPO χρησιμοποιώντας τεχνολογία ανασυνδυασμού DNA.

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΕΡΟ έχει την ίδια αλληλουχία με την ενδογενή πρωτεΐνη ΕΡΟ και επίσης έχει παρόμοια τροποποίηση γλυκοζυλίωσης. Φυσικά, η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΕΡΟ έχει επίσης τη δράση της ενδογενούς ΕΡΟ. Τον Ιούνιο του 1989, το πρώτο προϊόν της Amgen, η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ερυθροποιητίνη Epogen, εγκρίθηκε από τον FDA των ΗΠΑ για τη θεραπεία της αναιμίας που προκαλείται από χρόνια νεφρική ανεπάρκεια και της αναιμίας στη θεραπεία της λοίμωξης HIV. Οι πωλήσεις της Epogen ξεπέρασαν τα 16 εκατομμύρια δολάρια σε μόλις τρεις μήνες. Τις επόμενες δύο δεκαετίες, η Amgen κυριάρχησε στην αγορά ανασυναρμολογημένου ανθρώπινου EPO. Η Epogen απέφερε έσοδα 2,5 δισεκατομμυρίων δολαρίων στην Amgen μόνο το 2010. Το 2018, η χρηματιστηριακή αξία της Amgen ήταν 128,8 δισεκατομμύρια δολάρια, καθιστώντας την την όγδοη μεγαλύτερη φαρμακευτική εταιρεία στον κόσμο.

Αξίζει να σημειωθεί ότι η Amgen αρχικά συνεργάστηκε με την Goldwasser για την παροχή καθαρών ανθρώπινων πρωτεϊνών EPO για αλληλούχιση, αλλά η Goldwasser και η Amgen σύντομα έπεσαν έξω λόγω ιδεολογικών διαφορών. Ο Goldwasser και το Πανεπιστήμιο του του Σικάγο, που έκαναν βασική έρευνα, δεν σκέφτηκαν ποτέ να πατεντάρουν την ορμόνη που ανακάλυψε, και έτσι δεν έχουν λάβει ούτε μια δεκάρα για την τεράστια εμπορική επιτυχία της EPO.

Είναι - πώς είναι διεγερτικό

Όταν αναπνέουμε, το οξυγόνο εισέρχεται στα μιτοχόνδρια των κυττάρων για να οδηγήσει την αναπνευστική αλυσίδα και να παράγει τεράστιες ποσότητες ATP, την κύρια πηγή ενέργειας στο σώμα μας. Τα αναιμικά άτομα δεν έχουν αρκετά υγιή ερυθρά αιμοσφαίρια και το πιο άμεσο αποτέλεσμα είναι ότι δεν προσλαμβάνουν αρκετό οξυγόνο, κάτι που τους κάνει να αισθάνονται κουρασμένοι, παρόμοια με αναπνευστικά προβλήματα κατά τη διάρκεια μιας μακράς διαδρομής. Όταν εγχέεται με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη EPO, τα σώματα των ασθενών με αναιμία παράγουν περισσότερα ερυθρά αιμοσφαίρια,μεταφέρουν περισσότερο οξυγόνο και παράγουν περισσότερο από το ενεργειακό μόριο ATP, ανακουφίζοντας αποτελεσματικά τα συμπτώματα.

Ωστόσο, ορισμένοι εργαζόμενοι στον αθλητισμό έχουν επίσης αρχίσει να σκέφτονται την ανασυνδυασμένη ανθρώπινη EPO. Εάν η τεχνητή ανασυνδυασμένη ορμόνη τύπου EPO χρησιμοποιηθεί για να διεγείρει το σώμα των αθλητών να παράγει περισσότερα ερυθρά αιμοσφαίρια, είναι δυνατό να βελτιωθεί η ικανότητα των αθλητών να λαμβάνουν οξυγόνο και να παράγουν μόρια ενέργειας, τα οποία μπορούν επίσης να βελτιώσουν την απόδοση των αθλητών σε αντοχή. εκδηλώσεις όπως η ποδηλασία, το τρέξιμο μεγάλων αποστάσεων και το σκι αντοχής. Μια εργασία του 1980 στο Journal of Applied Physiology έδειξε ότι τα διεγερτικά του αίματος (ερυθροποιητίνη, τεχνητοί φορείς οξυγόνου και μεταγγίσεις αίματος) μπορούν να αυξήσουν την αντοχή κατά 34 τοις εκατό. Εάν οι αθλητές χρησιμοποιούν το EPO, μπορούν να τρέξουν 8 χιλιόμετρα στον διάδρομο σε 44 δευτερόλεπτα λιγότερο χρόνο από πριν. Στην πραγματικότητα, η ποδηλασία και οι μαραθώνιοι ήταν οι χειρότεροι παραβάτες για διεγερτικά ΕΠΟ. Κατά τη διάρκεια του Tour de France του 1998, ένας γιατρός της Ισπανικής ομάδας της ομάδας Festina συνελήφθη στα γαλλικά σύνορα με 400 μπουκάλια τεχνητού ανασυνδυασμένου EPO! Το αποτέλεσμα, φυσικά, ήταν να αποβληθεί ολόκληρη η ομάδα από το Tour και να αποκλειστεί.

Η Διεθνής Ολυμπιακή Επιτροπή πρόσθεσε την ΕΠΟ στον απαγορευμένο της κατάλογο στους Αγώνες της Βαρκελώνης το 1992, αλλά η αναδιοργάνωση των δοκιμών σε ανθρώπους ήταν τόσο δύσκολη που πριν από τους Αγώνες του 2000 δεν υπήρχε τρόπος να εντοπιστεί αποτελεσματικά εάν οι αθλητές το χρησιμοποιούσαν. Υπάρχουν διάφοροι λόγοι: 1) Η περιεκτικότητα σε EPO στα σωματικά υγρά είναι πολύ χαμηλή και η EPO ανά ml αίματος σε φυσιολογικούς ανθρώπους είναι περίπου 130-230 νανογραμμάρια. 2) Η σύνθεση αμινοξέων της τεχνητής ανασυνδυασμένης ΕΡΟ είναι ακριβώς η ίδια με εκείνη της ανθρώπινης ενδογενούς πρωτεΐνης ΕΡΟ, μόνο που η μορφή γλυκοζυλίωσης είναι πολύ ελαφρώς διαφορετική. 3) Ο χρόνος ημιζωής της ΕΡΟ στο αίμα είναι μόνο 5-6 ώρες και γενικά είναι μη ανιχνεύσιμος 4-7 ημέρες μετά την τελευταία ένεση. 4) Το ατομικό επίπεδο EPO είναι πολύ διαφορετικό, επομένως είναι δύσκολο να καθοριστεί ένα απόλυτο ποσοτικό πρότυπο.

Από το 2000, η ​​WADA χρησιμοποιεί τον έλεγχο ούρων ως τη μόνη επιστημονική μέθοδο επαλήθευσης για την άμεση ανίχνευση ανασυνδυασμένης EPO. Λόγω των μικρών διαφορών μεταξύ της γλυκοϋλιωμένης μορφής της τεχνητής ανασυνδυασμένης ΕΡΟ και αυτής της ανθρώπινης ΕΡΟ, οι φορτισμένες ιδιότητες των δύο μορίων είναι πολύ μικρές και μπορούν να διακριθούν με μια μέθοδο ηλεκτροφόρησης που ονομάζεται ισοηλεκτρική εστίαση, η οποία είναι η κύρια στρατηγική για την άμεση ανίχνευση της τεχνητής ανασυνδυασμένης ΕΡΟ. Ωστόσο, κάποια ανασυνδυασμένη ΕΡΟ που εκφράζεται από ανθρώπινα κύτταρα δεν εμφάνισαν διαφορά στη γλυκοζυλίωση, έτσι ορισμένοι ειδικοί πρότειναν ότι η εξωγενής ΕΡΟ και η ενδογενής ΕΡΟ πρέπει να διακρίνονται από διαφορετική περιεκτικότητα σε ισότοπο άνθρακα.

Στην πραγματικότητα, εξακολουθούν να υπάρχουν περιορισμοί σε διαφορετικές μεθόδους δοκιμών για το EPO. Για παράδειγμα, ο Λανς Άρμστρονγκ, ο Αμερικανός θρύλος της ποδηλασίας, παραδέχτηκε ότι πήρε EPO και άλλα διεγερτικά κατά τη διάρκεια των επτά νικών του στον Γύρο της Γαλλίας, αλλά στην πραγματικότητα δεν επιβεβαιώθηκε θετικός για EPO σε κανένα τεστ ντόπινγκ εκείνη τη στιγμή. Πρέπει ακόμα να περιμένουμε να δούμε αν είναι «ένα πόδι ψηλότερα» ή «ένα πόδι ψηλότερα».

Πώς γίνεται το βραβείο Νόμπελ

Μια τελευταία λέξη για τη σύνδεση μεταξύ της EPO και του Βραβείου Νόμπελ 2019 στη Φυσιολογία ή την Ιατρική.

Η ΕΡΟ είναι η πιο χαρακτηριστική περίπτωση αντίληψης και ανταπόκρισης του ανθρώπινου σώματος στην υποξία. Ως εκ τούτου, η Semenza και ο Ratcliffe, δύο νομπελίστες, επέλεξαν την EPO ως αφετηρία για τη μελέτη του μηχανισμού της κυτταρικής αντίληψης και προσαρμογής στην υποξία. Το πρώτο βήμα ήταν να βρεθούν τα στοιχεία του γονιδίου EPO που θα μπορούσαν να ανταποκριθούν στις αλλαγές οξυγόνου. Η Semenza αναγνώρισε μια βασική μη κωδικοποιητική αλληλουχία 256 βάσεων στο 3' κατάντη άκρο του γονιδίου που κωδικοποιεί την ΕΡΟ, που ονομάζεται στοιχείο απόκρισης υποξίας. Εάν αυτή η αλληλουχία στοιχείων μεταλλαχθεί ή διαγραφεί, η ικανότητα της πρωτεΐνης ΕΡΟ να ανταποκρίνεται στην υποξία μειώνεται σημαντικά. Εάν αυτή η αλληλουχία στοιχείων συγχωνευθεί στο κατάντη 3' άκρο άλλων γονιδίων που δεν σχετίζονται με την υποξία, αυτά τα τροποποιημένα γονίδια δείχνουν επίσης ενεργοποίηση παρόμοια με EPOυπό συνθήκες υποξίας.

Ο Ράτκλιφ και η ομάδα του ανακάλυψαν στη συνέχεια ότι αυτό το στοιχείο υποξικής απόκρισης δεν υπάρχει μόνο στα κύτταρα των νεφρών ή του ήπατος που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή της ΕΡΟ, αλλά και σε πολλούς άλλους τύπους κυττάρων που μπορούν να λειτουργήσουν υπό συνθήκες υποξίας. Με άλλα λόγια, αυτή η απόκριση στην υποξία μπορεί να μην είναι ειδική για την ΕΡΟ, αλλά μάλλον ένα πιο διαδεδομένο φαινόμενο στα κύτταρα. Αυτά τα άλλα κύτταρα, τα οποία δεν είναι υπεύθυνα για την παραγωγή EPO, πρέπει να περιέχουν μόρια (όπως μεταγραφικούς παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων) που αντιλαμβάνονται τις αλλαγές στη συγκέντρωση οξυγόνου και συνδέονται με στοιχεία υποξικής απόκρισης για να ενεργοποιήσουν γονίδια όπως το EPO.