Þrír handhafar Nóbelsverðlaunanna í lífeðlisfræði eða læknisfræði 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza og Sir Peter J. Ratcliffe höfðu þegar unnið Lasker-verðlaunin í grunnlækningum 2016 fyrir vinnu sína við hvernig frumur skynja og aðlagast. til súrefnisskorts, svo það kom ekkert sérstaklega á óvart. Þeir uppgötvuðu og auðkenndu lykilsameindina súrefnisskortsframkallanlega þáttur 1 (HIF-1). Í dag viljum við hverfa aftur að uppruna rannsóknarinnar, sem er rauðkornavaka, eða EPO, kraftaverkasameind.

Það er mikilvægasti þátturinn í framleiðslu rauðra blóðkorna

Rauð blóðkorn eru algengasta tegund blóðkorna í blóði og eru aðalmiðillinn til að flytja súrefni og koltvísýring í gegnum blóð hryggdýra. Rauðfrumur myndast í beinmerg: Blóðmyndandi stofnfrumur fjölga sér fyrst og aðgreinast í forfrum ýmissa blóðkorna og rauðkornaforfrumum geta aðgreint sig enn frekar og þroskast í rauðkorn. Undir venjulegum kringumstæðum er framleiðsluhraði rauðkorna í mönnum mjög lágt, en við streitu eins og blæðingu, blóðleysi og súrefnisskort getur hraða framleiðslu rauðkorna aukist um allt að átta sinnum. Í þessu ferli er rauðkornavaka EPO einn mikilvægasti þátturinn.

EPO er hormón sem myndast aðallega í nýrum. Efnafræðilegt eðli þess er mjög glýkósýlerað prótein. Af hverju í nýrum? Um það bil lítri af blóði streymir í gegnum nýrun á hverri mínútu, svo þau geta fljótt og vel greint breytingar á súrefnismagni í blóði. Þegar súrefnismagn í blóði er lágt bregðast nýrun hratt við og framleiða mikið magn af EPO. Hið síðarnefnda streymir í gegnum blóðrásina til beinmergs, þar sem það stuðlar að umbreytingu rauðkornaforfrumna í rauð blóðkorn. Þroskuð rauð blóðkorn losna úr beinmerg inn í blóðrásarkerfið til að bæta getu líkamans til að bindast súrefni. Þegar nýrun skynja aukningu á súrefni í blóði draga þau úr EPO framleiðslu, sem aftur dregur úr magni rauðra blóðkorna í beinmerg.

Þetta gerir fullkomna aðlögunarlykkju. Hins vegar, fólk sem býr í mikilli hæð og sumir blóðleysissjúklingar lenda oft í ástandi stöðugt lágs súrefnismagns í blóði, sem getur ekki lokið ofangreindu blóðrásinni og örvað nýrun til að seyta stöðugt EPO, þannig að styrkur EPO í blóði er hærri en venjulegt fólk.

Það tók næstum 80 ár að afhjúpa það

Eins og margar helstu uppgötvanir, hefur skilningur vísindamanna á EPO ekki gengið snurðulaust, með spurningum og áskorunum á leiðinni. Það liðu næstum 80 ár frá hugmyndinni um EPO til lokaákvörðunar á tilteknu sameindinni.

Árið 1906 sprautuðu frönsku vísindamennirnir Carnot og Deflandre venjulegum kanínum með sermi blóðleysis kanína og komust að því að fjöldi rauðra blóðkorna í plasma venjulegra kanína jókst. Þeir töldu að sumir humoral þættir í plasma gætu örvað og stjórnað framleiðslu rauðra blóðkorna. Þetta var fyrsta EPO hugmynd frumgerðin. Því miður hafa niðurstöðurnar ekki verið endurteknar á næstu áratugum, aðallega vegna þess að fjöldi nýrra rauðra blóðkorna var ekki nákvæmur.

Tilraun Reissmann og Ruhenstroth-Bauer árið 1950 gaf mjög sterkar sannanir. Þeir tengdu blóðrásarkerfi tveggja lifandi rotta með skurðaðgerð og settu aðra í súrefnisskort og hina andaði að sér eðlilegu lofti. Þess vegna framleiddu báðar mýsnar gríðarlegt magn af rauðum blóðkornum. Það er enginn vafi á því að það er hormón í blóðrásinni sem örvar framleiðslu rauðra blóðkorna, sem EPO dregur nafn sitt af. Aftur á móti er EPO mjög viðkvæmt fyrir súrefnisskorti.

Hvaða sameind er EPO? Það tók bandaríska vísindamanninn Goldwasser 30 ár að loksins skýra vandamálið á lífefnafræðilegu stigi. Ef verkamaður vill vinna gott starf verður hann fyrst að brýna verkfæri sín. Hlutverk EPO er að örva ný rauð blóðkorn, entalning þess síðarnefnda er ekki nákvæm. Mikilvægasta starfræna sameindin í rauðum blóðkornum er hemóglóbín sem inniheldur hem, sem inniheldur járnjón í miðju þess. Teymi Goldwasser merkti því nýfædd rauð blóðkorn með geislavirkum járnsamsætum og þróaði viðkvæma aðferð til að greina EPO virkni. Þetta gerir það mögulegt að einangra og hreinsa mjög lágan styrk af EPO (nanogrömm á millilítra) úr dýravökvasýnum. En einangrun EPO var afar erfið. Þeir skiptu úr nýrum yfir í blóðleysi sauðfjárplasma, yfir í þvag sjúklinga með alvarlegan járnskort vegna krókaormasýkingar og loks, árið 1977, hreinsuðu 8 milligrömm af EPO próteini úr 2.550 lítrum af þvagi frá japönskum sjúklingum með vanmyndunarblóðleysi.

Árið 1985 var próteinraðgreiningu og genaklónun á EPO manna lokið. EPO genið kóðar fjölpeptíð með 193 amínóleifum, sem verður þroskað prótein sem samanstendur af 166 amínósýruleifum eftir að merkjapeptíðið er klippt við seytingu, og inniheldur 4 staði til að breyta glýkósýleringu. Árið 1998 var NMR lausnarbygging EPO og kristalbygging EPO og viðtakakomplex þess greind. Á þessum tímapunkti hefur fólk mest innsæi skilning á EPO.

Hingað til hefur meðferð við blóðleysi venjulega þurft blóðgjafir til að bæta upp skort á rauðum blóðkornum. Þegar fólk lærir meira um EPO hefur það auðveldað vandamálið að sprauta því til að örva framleiðslu rauðra blóðkorna í eigin beinmerg. En það er erfitt að hreinsa EPO beint úr líkamsvökva, eins og Goldwasser gerði, og uppskeran lág. Ákvörðun á EPO próteini og gena röð gerði það mögulegt að framleiða raðbrigða EPO úr mönnum í miklu magni.

Það var gert af líftæknifyrirtæki sem heitir Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen var stofnað árið 1980 með aðeins sjö meðlimum, í von um að geta framleitt líflyf með sameindalíffræði sem þá var að koma fram. Interferon, vaxtarhormónslosandi þáttur, lifrarbólgu B bóluefni, húðþekjuvaxtarþáttur voru meðal heitustu nöfnanna á lista yfir skotmörk þeirra, en engin þessara tilrauna heppnaðist. Fram til ársins 1985 klónaði Lin Fukun, kínverskur vísindamaður frá Taívan í Kína, gen EPO úr mönnum og gerði sér síðan grein fyrir framleiðslu á tilbúnu EPO með DNA endurröðunartækni.

Raðbrigða EPO úr mönnum hefur sömu röð og innrænt EPO prótein og hefur einnig svipaða glýkósýleringarbreytingu. Auðvitað hefur raðbrigða EPO úr mönnum einnig virkni innræns EPO. Í júní 1989 var fyrsta vara Amgen, raðbrigða rauðkornavaka Epogen úr mönnum, samþykkt af bandaríska FDA til meðhöndlunar á blóðleysi af völdum langvarandi nýrnabilunar og blóðleysis við meðhöndlun á HIV sýkingu. Sala Epogen fór yfir 16 milljónir dala á aðeins þremur mánuðum. Á næstu tveimur áratugum var Amgen ráðandi á markaðnum fyrir samansett EPO úr mönnum. Epogen færði Amgen 2,5 milljarða dollara í tekjur árið 2010 eingöngu. Árið 2018 var verðmæti hlutabréfa Amgen 128,8 milljarðar dala, sem gerir það að áttunda stærsta lyfjafyrirtæki í heimi.

Þess má geta að Amgen vann upphaflega með Goldwasser við að útvega hreinsað EPO prótein úr mönnum til raðgreiningar, en Goldwasser og Amgen féllu fljótlega út vegna hugmyndafræðilegs ágreinings. Goldwasser og Chicago-háskóli hans, sem gerði grunnrannsóknir, datt aldrei í hug að einkaleyfi á hormóninu sem hann uppgötvaði og hafa því ekki fengið krónu fyrir gríðarlegan viðskiptalegan árangur EPO.

Það - hvernig er það örvandi

Þegar við öndum fer súrefni inn í hvatbera frumnanna til að knýja öndunarkeðjuna og framleiða gríðarlegt magn af ATP, aðalorkugjafa líkama okkar. Fólk með blóðleysi hefur ekki nóg af heilbrigðum rauðum blóðkornum og áhrifamestu áhrifin eru þau að þeir taka ekki inn nóg súrefni sem gerir það að verkum að það finnur fyrir þreytu, svipað og öndunarerfiðleikar í langan tíma. Þegar það er sprautað með raðbrigða EPO úr mönnum framleiðir líkami blóðleysissjúklinga fleiri rauð blóðkorn,bera meira súrefni og framleiða meira af orkusameindinni ATP, sem dregur í raun úr einkennum.

Hins vegar eru sumir íþróttastarfsmenn einnig farnir að hugsa um raðbrigða EPO úr mönnum. Ef gervi raðbrigðahormónið af EPO gerð er notað til að örva líkama íþróttamannanna til að framleiða fleiri rauð blóðkorn, er hægt að bæta getu íþróttamannanna til að fá súrefni og framleiða orkusameindir, sem einnig getur bætt árangur íþróttamanna í þrek. viðburðir eins og hjólreiðar, langhlaup og gönguskíði. Ritgerð árið 1980 í Journal of Applied Physiology sýndi að blóðörvandi lyf (rauðkornavaka, gervi súrefnisberar og blóðgjafir) geta aukið þol um 34 prósent. Ef íþróttamenn nota EPO geta þeir hlaupið 8 kílómetra á hlaupabrettinu á 44 sekúndum styttri tíma en áður. Reyndar hafa hjólreiðar og maraþon verið verst brotlegir fyrir EPO örvandi lyf. Á Tour de France 1998 var spænskur liðslæknir Festina liðsins handtekinn við frönsku landamærin með 400 flöskur af gervi raðbrigða EPO! Niðurstaðan var auðvitað sú að allt liðið var rekið út úr Tour og sett í bann.

Alþjóðaólympíunefndin bætti EPO á bannlista sinn á leikunum í Barcelona 1992, en endurskipulagning á EPO-prófum á mönnum var svo erfið að fyrir 2000 leikana var engin leið til að greina í raun hvort íþróttamenn notuðu það. Það eru nokkrar ástæður: 1) EPO innihald í líkamsvökva er mjög lágt og EPO á ml af blóði hjá venjulegu fólki er um 130-230 nanógrömm; 2) Amínósýrusamsetning gervi raðbrigða EPO er nákvæmlega sú sama og innræn EPO prótein úr mönnum, aðeins form glýkósýleringar er mjög örlítið öðruvísi; 3) Helmingunartími EPO í blóði er aðeins 5-6 klukkustundir, og hann er almennt ógreinanlegur 4-7 dögum eftir síðustu inndælingu; 4) Einstaklingsstig EPO er mjög mismunandi, svo það er erfitt að koma á algerum magnstaðli.

Síðan 2000 hefur WADA notað þvagpróf sem eina vísindalega sannprófunaraðferðina til að greina raðbrigða EPO beint. Vegna lítils munar á glýkóýleruðu formi gervi raðbrigða EPO og mannlegs EPO, eru hlaðnir eiginleikar sameindanna tveggja mjög litlir og hægt að greina á milli þeirra með rafdrætti sem kallast jafnrafræn fókus, sem er aðalaðferðin fyrir beina greiningu á gervi raðbrigða EPO. Hins vegar sýndu sumt raðbrigða EPO tjáð af frumum úr mönnum engan mun á glýkósýleringu, svo sumir sérfræðingar lögðu til að utanaðkomandi EPO og innræn EPO ættu að vera aðgreindar með mismunandi kolefnissamsætuinnihaldi.

Reyndar eru enn takmarkanir á mismunandi prófunaraðferðum fyrir EPO. Til dæmis, Lance Armstrong, bandaríska hjólreiðagoðsögnin, viðurkenndi að hafa tekið EPO og önnur örvandi efni á sjö sigrum sínum í Tour de France, en hann var reyndar ekki staðfestur fyrir EPO í neinu lyfjaprófi á þeim tíma. Við verðum samt að bíða og sjá hvort það sé „einum feti hærra“ eða „einu feti hærra“.

Hvernig gerir það Nóbelsverðlaun

Lokaorð um tengsl EPO og Nóbelsverðlaunanna 2019 í lífeðlisfræði eða læknisfræði.

EPO er dæmigerðasta tilfellið af skynjun mannslíkamans og viðbrögð við súrefnisskorti. Þess vegna völdu Semenza og Ratcliffe, tveir Nóbelsverðlaunahafar, EPO sem upphafspunkt til að rannsaka aðferð frumuskynjunar og aðlögunar að súrefnisskorti. Fyrsta skrefið var að finna þætti EPO gensins sem gætu brugðist við súrefnisbreytingum. Semenza greindi lykilröð 256 basa sem ekki er kóðað við 3 'neðarenda gensins sem kóðar EPO, nefnd súrefnissvörun. Ef þessi frumefnaröð er stökkbreytt eða henni eytt minnkar geta EPO próteinsins til að bregðast við súrefnisskorti til muna. Ef þessi frumefnisröð er sameinuð við 3'-enda annarra gena sem ekki tengjast súrefnisskorti, sýna þessi breyttu gen einnig EPO-líka virkjunvið súrefnisskort.

Ratcliffe og teymi hans komust þá að því að þessi súrefnissvörunarþáttur er ekki aðeins til staðar í nýrum eða lifrarfrumum sem bera ábyrgð á framleiðslu EPO, heldur einnig í mörgum öðrum frumugerðum sem geta virkað við súrefnisskort. Með öðrum orðum, þessi viðbrögð við súrefnisskorti eru kannski ekki sértæk fyrir EPO, heldur frekar útbreiddari fyrirbæri í frumum. Þessar aðrar frumur, sem eru ekki ábyrgar fyrir EPO framleiðslu, verða að innihalda sameindir (eins og umritunarþætti sem bera ábyrgð á að kveikja á genatjáningu) sem skynja breytingar á súrefnisstyrk og bindast súrefnissvörunarþáttum til að kveikja á genum eins og EPO.