Тројцата добитници на Нобеловата награда за физиологија или медицина за 2019 година, Вилијам Г. Келин, Џуниор, Грег Л. Семенза и Сер Питер Ј. до хипоксија, па затоа не беше особено изненадувачки. Тие ја открија и идентификуваа клучната молекула фактор 1 што предизвикува хипоксија (HIF-1). Денес сакаме да се вратиме на потеклото на студијата, што е еритропоетин, или ЕПО, чудотворна молекула.
Тоа е најважниот фактор за производство на црвени крвни зрнца
Црвените крвни зрнца се најзастапениот тип на крвни зрнца во крвта и се главниот медиум за транспорт на кислород и јаглерод диоксид преку крвта на 'рбетниците. Еритроцитите се генерираат во коскената срцевина: Хематопоетските матични клетки прво се размножуваат и се диференцираат во прогенитори на различни крвни клетки, а еритроидните прогенитори може дополнително да се диференцираат и созреваат во еритроцити. Во нормални услови, стапката на производство на човечки еритроцити е многу ниска, но под стрес како што се крварење, хемолиза и хипоксија, стапката на производство на еритроцити може да се зголеми до осум пати. Во овој процес, еритропоетинот ЕПО е еден од најважните фактори.
ЕПО е хормон кој се синтетизира главно во бубрегот. Неговата хемиска природа е високо гликолизиран протеин. Зошто во бубрезите? Околу еден литар крв тече низ бубрезите секоја минута, така што тие можат брзо и ефикасно да ги детектираат промените во нивото на кислород во крвта. Кога нивото на кислород во крвта е ниско, бубрезите реагираат брзо и произведуваат големи количини на ЕПО. Вториот циркулира низ крвотокот до коскената срцевина, каде што промовира конверзија на еритроидните прогениторни клетки во црвени крвни зрнца. Зрелите црвени крвни зрнца се ослободуваат од коскената срцевина во циркулаторниот систем за да се подобри способноста на телото да се врзува за кислородот. Кога бубрезите чувствуваат зголемување на кислородот во крвта, тие го намалуваат производството на ЕПО, што пак го намалува количеството на црвени крвни зрнца во коскената срцевина.
Ова прави совршена јамка за прилагодување. Меѓутоа, луѓето кои живеат на голема надморска височина и некои пациенти со анемија често се соочуваат со состојба на континуирано ниско ниво на кислород во крвта, што не може да ја заврши горенаведената циркулација и да го стимулира бубрегот постојано да лачи ЕПО, така што концентрацијата на ЕПО во крвта е повисока од обичните луѓе.
Беа потребни речиси 80 години за да се открие
Како и многу големи откритија, разбирањето на научниците за ЕПО не беше лесно, со прашања и предизвици на патот. Беа потребни речиси 80 години од концептот на ЕПО до конечното определување на специфичната молекула.
Во 1906 година, француските научници Карно и Дефландре на нормалните зајаци им инјектирале серум од анемични зајаци и откриле дека бројот на црвените крвни зрнца во плазмата на нормалните зајаци се зголемува. Тие веруваа дека некои хуморални фактори во плазмата можат да го стимулираат и регулираат производството на црвени крвни зрнца. Ова беше првиот EPO концепт прототип. За жал, резултатите не беа повторени во следните децении, главно поради тоа што бројот на нови црвени крвни зрнца не беше точен.
Експериментот за парабиоза на Рајсман и Рухенстрот-Бауер во 1950 година обезбеди навистина силни докази. Тие хируршки ги поврзаа циркулаторните системи на два живи стаорци, ставајќи го едниот во хипоксична средина, а другиот дише нормален воздух. Како резултат на тоа, двата глувци произведоа огромни количини црвени крвни зрнца. Несомнено е дека во крвотокот постои хормон кој го стимулира производството на црвени крвни зрнца, од кои ЕПО го добива името. Од друга страна, ЕПО е многу чувствителна на хипоксија.
Која молекула е ЕПО? На американскиот научник Голдвасер му беа потребни 30 години за конечно да го разјасни проблемот на биохемиско ниво. Ако работникот сака добро да ја заврши работата, прво мора да ги изостри алатите. Функцијата на ЕПО е да стимулира нови црвени крвни зрнца, ноброењето на второто не е точно. Најважната функционална молекула во црвените крвни зрнца е хемоглобинот кој содржи хем, кој содржи железен јон во својот центар. Така, тимот на Голдвасер ги означи црвените крвни зрнца на новороденчиња со изотопи на радиоактивни железо и разви чувствителен метод за откривање на активноста на ЕПО. Ова овозможува да се изолираат и прочистат многу ниските концентрации на EPO (нанограми на милилитар) од примероци од животинска течност. Но, изолацијата на ЕПО беше исклучително тешка. Тие се префрлија од бубрежна на анемична овча плазма, на урина на пациенти со тежок дефицит на железо поради инфекција со анкилостома, и конечно, во 1977 година, прочистија 8 милиграми човечки ЕПО протеин од 2.550 литри урина од јапонски пациенти со апластична анемија.
Во 1985 година, секвенционирањето на протеините и генското клонирање на човечката ЕПО беа завршени. ЕПО генот кодира полипептид со 193 амино остатоци, кој станува зрел протеин составен од 166 амино киселински остатоци откако сигналниот пептид ќе се исече за време на секрецијата и содржи 4 места за модификација на гликозилацијата. Во 1998 година, беа анализирани NMR раствор структурата на EPO и кристалната структура на EPO и неговиот рецепторен комплекс. Во овој момент, луѓето имаат најинтуитивно разбирање за ЕПО.
Досега, третманот за анемија обично бараше трансфузија на крв за да се надополни недостатокот на црвени крвни зрнца. Како што луѓето дознаваат повеќе за ЕПО, неговото инјектирање за да се стимулира производството на црвени крвни зрнца во сопствената коскена срцевина го олесни проблемот. Но, прочистувањето на ЕПО директно од телесните течности, како што направи Голдвасер, е тешко и приносите се ниски. Одредувањето на EPO протеинот и генската секвенца овозможи да се произведе рекомбинантна човечка EPO во големи количини.
Тоа беше направено од биотехнолошка компанија наречена Applied Molecular Genetics (Amgen). Амген е основана во 1980 година со само седум членови, надевајќи се дека ќе произведува биофармацевтски производи со техниките на молекуларна биологија кои тогаш се појавија. Интерферон, фактор за ослободување на хормонот за раст, вакцина против хепатитис Б, фактор на епидермален раст беа меѓу жешките имиња на нивната листа на цели, но ниту еден од овие обиди не успеа. До 1985 година, Лин Фукун, кинески научник од Тајван, Кина, го клонирал генот на човечката ЕПО, а потоа го реализирал производството на синтетичка ЕПО користејќи технологија за рекомбинација на ДНК.
Рекомбинантниот човечки ЕПО ја има истата низа како ендогениот ЕПО протеин, а исто така има слична модификација на гликозилација. Природно, рекомбинантната човечка ЕПО, исто така, има активност на ендогени ЕПО. Во јуни 1989 година, првиот производ на Amgen, рекомбинантниот човечки еритропоетин Епоген, беше одобрен од страна на американската ФДА за третман на анемија предизвикана од хронична бубрежна инсуфициенција и анемија во третманот на ХИВ инфекција. Продажбата на Epogen надмина 16 милиони долари за само три месеци. Во текот на следните две децении, Amgen доминираше на пазарот за повторно составена човечка EPO. Епоген само во 2010 година на Амген му донесе приход од 2,5 милијарди долари. Во 2018 година, вредноста на берзата на Amgen беше 128,8 милијарди долари, што ја прави осмата најголема фармацевтска компанија во светот.
Вреди да се напомене дека Амген првично работеше со Голдвасер за да обезбеди прочистени човечки ЕПО протеини за секвенционирање, но Голдвасер и Амген набрзо паднаа поради идеолошки разлики. Голдвасер и неговиот Универзитет во Чикаго, кои правеа основни истражувања, никогаш не помислија да го патентираат хормонот што тој го откри, па затоа не добија ниту денар за огромниот комерцијален успех на ЕПО.
Тоа -- како е стимуланс
Кога дишеме, кислородот влегува во митохондриите на клетките за да го придвижи респираторниот синџир и да произведе огромни количини на АТП, главниот извор на енергија во нашите тела. Анемичните луѓе немаат доволно здрави црвени крвни зрнца, а најнепосреден ефект е тоа што не внесуваат доволно кислород, поради што се чувствуваат уморни, слично на проблемите со дишењето за време на долг рок. Кога се инјектира со рекомбинантна човечка ЕПО, телото на пациентите со анемија произведува повеќе црвени крвни зрнца,носат повеќе кислород и произведуваат повеќе од енергетската молекула АТП, што ефикасно ги ублажува симптомите.
Сепак, некои спортски работници исто така почнаа да размислуваат за рекомбинантна човечка ЕПО. Ако вештачкиот рекомбинантен хормон од типот ЕПО се користи за стимулирање на телото на спортистите да произведува повеќе црвени крвни зрнца, можно е да се подобри способноста на спортистите да добијат кислород и да произведуваат енергетски молекули, што исто така може да ги подобри перформансите на спортистите во издржливост. настани како што се велосипедизам, трчање на долги патеки и скијање крос-кантри. Еден труд од 1980 година во Журналот за применета физиологија покажа дека стимулансите на крвта (еритропоетин, вештачки носители на кислород и трансфузија на крв) можат да ја зголемат издржливоста за 34 проценти. Доколку спортистите користат ЕПО, можат да истрчаат 8 километри на лента за трчање за 44 секунди помалку од претходно. Всушност, велосипедизмот и маратоните се најлошите прекршувачи за стимулансите на ЕПО. За време на Тур де Франс 1998 година, шпански тимски лекар за тимот Фестина беше уапсен на француската граница со 400 шишиња вештачка рекомбинантна ЕПО! Резултатот, се разбира, беше дека целиот тим беше исфрлен од Тур и казнет.
Меѓународниот олимписки комитет го додаде ЕПО на својата забранета листа на Игрите во Барселона во 1992 година, но реорганизирањето на тестирањето на човечки ЕПО беше толку тешко што пред Игрите во 2000 година немаше начин ефикасно да се открие дали спортистите го користат. Постојат неколку причини: 1) Содржината на ЕПО во телесните течности е многу мала, а ЕПО на мл крв кај нормални луѓе е околу 130-230 нанограми; 2) Аминокиселинскиот состав на вештачкиот рекомбинантен ЕПО е сосема ист како оној на човечкиот ендогени ЕПО протеин, само формата на гликозилација е многу малку поинаква; 3) Полуживотот на ЕПО во крвта е само 5-6 часа и генерално не може да се открие 4-7 дена по последната инјекција; 4) Индивидуалното ниво на ЕПО е многу различно, па затоа е тешко да се воспостави апсолутен квантитативен стандард.
Од 2000 година, WADA го користи тестирањето на урината како единствен научен метод за верификација за директно откривање на рекомбинантна EPO. Поради малите разлики помеѓу гликоилираната форма на вештачката рекомбинантна ЕПО и онаа на човечката ЕПО, наелектризираните својства на двете молекули се многу мали и може да се разликуваат со методот на електрофореза наречен изоелектрично фокусирање, што е главната стратегија за директно откривање на вештачката рекомбинантна EPO. Сепак, некои рекомбинантни ЕПО изразени од клетки добиени од човек не покажаа разлика во гликозилацијата, така што некои експерти сугерираа дека егзогениот ЕПО и ендогениот ЕПО треба да се разликуваат по различна содржина на изотопи на јаглерод.
Всушност, сè уште има ограничувања во различните методи на тестирање за EPO. На пример, Ленс Армстронг, американската велосипедска легенда, призна дека земал ЕПО и други стимуланси за време на неговите седум победи на Тур де Франс, но тој всушност не беше потврден дека е позитивен на ЕПО на ниту еден допинг тест во тоа време. Останува да почекаме и да видиме дали е „една нога погоре“ или „една нога погоре“.
Како се прави Нобеловата награда
Последен збор за врската помеѓу ЕПО и Нобеловата награда за физиологија или медицина за 2019 година.
ЕПО е најтипичен случај на перцепција и одговор на човечкото тело на хипоксија. Затоа, Семенза и Ретклиф, двајца добитници на Нобеловата награда, го избраа ЕПО како почетна точка за проучување на механизмот на перцепција на клетките и адаптација на хипоксија. Првиот чекор беше да се пронајдат елементите на генот EPO кои можат да одговорат на промените на кислородот. Семенза идентификуваше клучна 256-базна некодирачка секвенца на 3' долниот крај на генот што го кодира EPO, наречен елемент на одговор на хипоксија. Ако оваа секвенца на елементи е мутирана или избришана, способноста на ЕПО протеинот да одговори на хипоксија е значително намалена. Ако оваа секвенца на елементи се спои со долниот 3' крај на други гени кои не се поврзани со хипоксија, овие модифицирани гени исто така покажуваат активирање слична на ЕПОво услови на хипоксија.
Ретклиф и неговиот тим потоа открија дека овој елемент на хипоксичен одговор не е присутен само во клетките на бубрезите или црниот дроб одговорни за производство на ЕПО, туку и во многу други типови на клетки кои можат да функционираат под хипоксични услови. Со други зборови, овој одговор на хипоксија можеби не е специфичен за ЕПО, туку повеќе распространет феномен во клетките. Овие други клетки, кои не се одговорни за производството на ЕПО, мора да содржат молекули (како што се факторите на транскрипција одговорни за вклучување на генската експресија) кои ги чувствуваат промените во концентрацијата на кислород и се врзуваат за елементите на хипоксичен одговор за да ги вклучат гените како што е ЕПО.
