De drie winnaars van de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza en Sir Peter J. Ratcliffe, hadden de Lasker Prize in Basic Medicine 2016 al gewonnen voor hun werk over hoe cellen voelen en zich aanpassen tot hypoxie, dus het was niet bijzonder verrassend. Ze ontdekten en identificeerden het sleutelmolecuul hypoxie-induceerbare factor 1 (HIF-1). Vandaag willen we teruggaan naar de oorsprong van de studie, namelijk erytropoëtine, of EPO, een wondermolecuul.

Het is de belangrijkste factor bij de productie van rode bloedcellen

Rode bloedcellen zijn het meest voorkomende type bloedcellen in het bloed en zijn het belangrijkste medium voor het transport van zuurstof en koolstofdioxide door het bloed van gewervelde dieren. Erytrocyten worden gegenereerd in het beenmerg: hematopoëtische stamcellen prolifereren eerst en differentiëren zich tot voorlopers van verschillende bloedcellen, en erytroïde voorlopers kunnen verder differentiëren en rijpen tot erytrocyten. Onder normale omstandigheden is de productiesnelheid van menselijke erytrocyten erg laag, maar onder stress zoals bloedingen, hemolyse en hypoxie kan de productiesnelheid van erytrocyten tot acht keer worden verhoogd. In dit proces is erytropoëtine EPO een van de belangrijkste factoren.

EPO is een hormoon dat voornamelijk in de nieren wordt gesynthetiseerd. De chemische aard ervan is een sterk geglycosyleerd eiwit. Waarom in de nieren? Elke minuut stroomt ongeveer een liter bloed door de nieren, zodat ze veranderingen in het zuurstofgehalte in het bloed snel en efficiënt kunnen detecteren. Wanneer het zuurstofgehalte in het bloed laag is, reageren de nieren snel en produceren grote hoeveelheden EPO. Deze laatste circuleert via de bloedbaan naar het beenmerg, waar het de omzetting van erytroïde voorlopercellen in rode bloedcellen bevordert. Rijpe rode bloedcellen komen uit het beenmerg vrij in de bloedsomloop om het vermogen van het lichaam om zuurstof te binden te verbeteren. Wanneer de nieren een toename van zuurstof in het bloed waarnemen, verminderen ze de EPO-productie, wat op zijn beurt de hoeveelheid rode bloedcellen in het beenmerg vermindert.

Dit maakt een perfecte aanpassingslus. Mensen die op grote hoogte leven en sommige bloedarmoedepatiënten hebben echter vaak te maken met een continu laag zuurstofgehalte in het bloed, waardoor de bovenstaande circulatie niet kan worden voltooid en de nieren worden gestimuleerd om continu EPO af te scheiden, zodat de EPO-concentratie in het bloed hoger is dan bij gewone mensen.

Het duurde bijna 80 jaar om het te ontdekken

Zoals veel grote ontdekkingen, verliep het begrip van EPO door wetenschappers niet van een leien dakje, met vragen en uitdagingen onderweg. Het duurde bijna 80 jaar van het concept van EPO tot de definitieve bepaling van het specifieke molecuul.

In 1906 injecteerden de Franse wetenschappers Carnot en Deflandre normale konijnen met het serum van anemische konijnen en ontdekten dat het aantal rode bloedcellen in het plasma van normale konijnen toenam. Ze geloofden dat sommige humorale factoren in het plasma de aanmaak van rode bloedcellen zouden kunnen stimuleren en reguleren. Dit was het eerste prototype van het EPO-concept. Helaas zijn de resultaten in de daaropvolgende decennia niet herhaald, voornamelijk omdat het aantal nieuwe rode bloedcellen niet nauwkeurig was.

Het parabiose-experiment van Reissmann en Ruhenstroth-Bauer in 1950 leverde echt sterk bewijs. Ze koppelden chirurgisch de bloedsomloop van twee levende ratten aan elkaar, plaatsten de ene in een hypoxische omgeving en de andere ademde normale lucht in. Als gevolg hiervan produceerden beide muizen enorme hoeveelheden rode bloedcellen. Het lijdt geen twijfel dat er een hormoon in de bloedbaan zit dat de aanmaak van rode bloedcellen stimuleert, waar EPO zijn naam aan ontleent. Aan de andere kant is EPO erg gevoelig voor hypoxie.

Welk molecuul is EPO? Het kostte de Amerikaanse wetenschapper Goldwasser 30 jaar om het probleem eindelijk op biochemisch niveau op te helderen. Als een arbeider goed werk wil leveren, moet hij eerst zijn gereedschap slijpen. De functie van EPO is het stimuleren van nieuwe rode bloedcellen, maarde telling van de laatste is niet nauwkeurig. Het belangrijkste functionele molecuul in rode bloedcellen is hemoglobine dat heem bevat, dat in het midden een ferro-ion bevat. Dus labelde het team van Goldwasser pasgeboren rode bloedcellen met radioactieve ijzerisotopen en ontwikkelde een gevoelige methode voor het detecteren van EPO-activiteit. Dit maakt het mogelijk om zeer lage concentraties EPO (nanogram per milliliter) uit dierlijke vloeistofmonsters te isoleren en te zuiveren. Maar de isolatie van EPO was buitengewoon moeilijk. Ze schakelden over van nierplasma op anemisch schapenplasma, op de urine van patiënten met ernstig ijzertekort als gevolg van mijnworminfectie, en tenslotte zuiverden ze in 1977 8 milligram menselijk EPO-eiwit uit 2550 liter urine van Japanse patiënten met aplastische anemie.

In 1985 werden de eiwitsequencing en genklonering van menselijk EPO voltooid. Het EPO-gen codeert voor een polypeptide met 193 aminoresiduen, dat een volwassen eiwit wordt dat is samengesteld uit 166 aminozuurresiduen nadat het signaalpeptide is geknipt tijdens secretie, en bevat 4 plaatsen voor glycosyleringsmodificatie. In 1998 werden de NMR-oplossingsstructuur van EPO en de kristalstructuur van EPO en zijn receptorcomplex geanalyseerd. Op dit moment hebben mensen het meest intuïtieve begrip van EPO.

Tot nu toe vereiste de behandeling van bloedarmoede meestal bloedtransfusies om het tekort aan rode bloedcellen aan te vullen. Naarmate mensen meer over EPO leren, is het probleem gemakkelijker geworden door het te injecteren om de productie van rode bloedcellen in hun eigen beenmerg te stimuleren. Maar EPO rechtstreeks uit lichaamsvloeistoffen zuiveren, zoals Goldwasser deed, is moeilijk en de opbrengsten zijn laag. De bepaling van het EPO-eiwit en de gensequentie maakte het mogelijk recombinant humaan EPO in grote hoeveelheden te produceren.

Het werd gedaan door een biotechnologiebedrijf genaamd Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen werd in 1980 opgericht met slechts zeven leden, in de hoop biofarmaceutica te maken met de toen opkomende technieken van de moleculaire biologie. Interferon, groeihormoon-afgevende factor, hepatitis B-vaccin, epidermale groeifactor behoorden tot de hete namen op hun lijst met doelwitten, maar geen van deze pogingen slaagde. Tot 1985 kloonde Lin Fukun, een Chinese wetenschapper uit Taiwan, China, het gen van menselijk EPO en realiseerde vervolgens de productie van synthetisch EPO met behulp van DNA-recombinatietechnologie.

Recombinant humaan EPO heeft dezelfde sequentie als endogeen EPO-eiwit en heeft ook vergelijkbare glycosyleringsmodificatie. Natuurlijk heeft recombinant humaan EPO ook de activiteit van endogeen EPO. In juni 1989 werd het eerste product van Amgen, recombinant humaan erytropoëtine Epogen, goedgekeurd door de Amerikaanse FDA voor de behandeling van bloedarmoede veroorzaakt door chronisch nierfalen en bloedarmoede bij de behandeling van HIV-infectie. De verkoop van Epogen bedroeg in slechts drie maanden tijd meer dan $ 16 miljoen. Gedurende de volgende twee decennia domineerde Amgen de markt voor opnieuw samengesteld menselijk EPO. Epogen bracht Amgen alleen al in 2010 $ 2,5 miljard aan inkomsten op. In 2018 bedroeg de beurswaarde van Amgen $ 128,8 miljard, waarmee het het achtste grootste farmaceutische bedrijf ter wereld is.

Het is vermeldenswaard dat Amgen aanvankelijk samenwerkte met Goldwasser om gezuiverde menselijke EPO-eiwitten te leveren voor sequencing, maar Goldwasser en Amgen vielen al snel uit vanwege ideologische meningsverschillen. Goldwasser en zijn Universiteit van Chicago, die fundamenteel onderzoek deden, hadden er nooit aan gedacht om het hormoon dat hij ontdekte te patenteren, en hebben dus geen cent ontvangen voor het enorme commerciële succes van EPO.

Het - hoe is het een stimulerend middel

Wanneer we ademen, komt zuurstof de mitochondriën van de cellen binnen om de ademhalingsketen aan te drijven en enorme hoeveelheden ATP te produceren, de belangrijkste energiebron in ons lichaam. Mensen met bloedarmoede hebben niet genoeg gezonde rode bloedcellen en het meest directe effect is dat ze niet genoeg zuurstof opnemen, waardoor ze zich moe voelen, vergelijkbaar met ademhalingsproblemen tijdens een lange duurloop. Wanneer het wordt geïnjecteerd met recombinant humaan EPO, produceren de lichamen van bloedarmoedepatiënten meer rode bloedcellen,vervoeren meer zuurstof en produceren meer van het energiemolecuul ATP, waardoor de symptomen effectief worden verlicht.

Sommige sporters zijn echter ook begonnen na te denken over recombinant humaan EPO. Als het kunstmatige recombinante hormoon van het EPO-type wordt gebruikt om het lichaam van de atleet te stimuleren om meer rode bloedcellen te produceren, is het mogelijk om het vermogen van de atleet om zuurstof te verkrijgen en energiemoleculen te produceren te verbeteren, wat ook de prestaties van atleten in uithoudingsvermogen kan verbeteren. evenementen zoals wielrennen, langeafstandslopen en langlaufen. Een paper uit 1980 in de Journal of Applied Physiology toonde aan dat bloedstimulerende middelen (erytropoëtine, kunstmatige zuurstofdragers en bloedtransfusies) het uithoudingsvermogen met 34 procent kunnen verhogen. Als sporters het EPO gebruiken, kunnen ze 8 kilometer hardlopen op de loopband in 44 seconden minder tijd dan voorheen. In feite zijn fietsen en marathons de ergste overtreders geweest voor EPO-stimulantia. Tijdens de Tour de France van 1998 werd een Spaanse teamdokter van het Festina-team gearresteerd aan de Franse grens met 400 flessen kunstmatige recombinant EPO! Het resultaat was natuurlijk dat de hele ploeg uit de Tour werd gezet en verbannen.

Het Internationaal Olympisch Comité voegde EPO toe aan zijn verboden lijst tijdens de Spelen van Barcelona in 1992, maar het reorganiseren van menselijke EPO-testen was zo moeilijk dat er vóór de Spelen van 2000 geen manier was om effectief te detecteren of atleten het gebruikten. Er zijn verschillende redenen: 1) het EPO-gehalte in lichaamsvloeistoffen is erg laag en EPO per ml bloed bij normale mensen is ongeveer 130-230 nanogram; 2) De aminozuursamenstelling van kunstmatig recombinant EPO is precies hetzelfde als die van humaan endogeen EPO-eiwit, alleen de vorm van glycosylering verschilt heel weinig; 3) De halfwaardetijd van EPO in het bloed is slechts 5-6 uur en is over het algemeen niet detecteerbaar 4-7 dagen na de laatste injectie; 4) Het individuele EPO-niveau is zeer verschillend, dus het is moeilijk om een ​​absolute kwantitatieve norm vast te stellen.

Sinds 2000 gebruikt het WADA urinetesten als de enige wetenschappelijke verificatiemethode voor directe detectie van recombinant EPO. Vanwege de kleine verschillen tussen de geglycosyleerde vorm van het kunstmatige recombinante EPO en die van het menselijke EPO, zijn de geladen eigenschappen van de twee moleculen erg klein en kunnen ze worden onderscheiden door een elektroforesemethode genaamd iso-elektrische focussering, wat de belangrijkste strategie is voor de directe detectie van het kunstmatige recombinante EPO. Sommige recombinante EPO's die tot expressie werden gebracht door van mensen afkomstige cellen vertoonden echter geen verschil in glycosylering, dus suggereerden sommige experts dat exogeen EPO en endogeen EPO zouden moeten worden onderscheiden door een verschillend koolstofisotoopgehalte.

In feite zijn er nog steeds beperkingen in verschillende testmethoden voor EPO. Lance Armstrong, de Amerikaanse wielerlegende, gaf bijvoorbeeld toe EPO en andere stimulerende middelen te hebben gebruikt tijdens zijn zeven Tour de France-overwinningen, maar hij werd op dat moment niet positief bevestigd voor EPO in een dopingtest op dat moment. We moeten nog afwachten of het "een voet hoger" of "een voet hoger" is.

Hoe maakt het een Nobelprijs

Een laatste woord over het verband tussen EPO en de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde 2019.

EPO is het meest typische geval van de perceptie en reactie van het menselijk lichaam op hypoxie. Daarom kozen Semenza en Ratcliffe, twee Nobelprijswinnaars, EPO als uitgangspunt om het mechanisme van celperceptie en aanpassing aan hypoxie te bestuderen. De eerste stap was het vinden van de elementen van het EPO-gen die zouden kunnen reageren op zuurstofveranderingen. Semenza identificeerde een belangrijke niet-coderende sequentie van 256 basen aan het 3' stroomafwaartse uiteinde van het gen dat codeert voor EPO, genaamd het hypoxie-responselement. Als deze elementsequentie wordt gemuteerd of verwijderd, wordt het vermogen van het EPO-eiwit om te reageren op hypoxie sterk verminderd. Als deze elementsequentie is gefuseerd met het stroomafwaartse 3'-uiteinde van andere genen die niet geassocieerd zijn met hypoxie, vertonen deze gemodificeerde genen ook EPO-achtige activeringonder hypoxie-omstandigheden.

Ratcliffe en zijn team ontdekten toen dat dit hypoxische responselement niet alleen aanwezig is in de nier- of levercellen die verantwoordelijk zijn voor de aanmaak van EPO, maar ook in veel andere celtypen die onder hypoxische omstandigheden kunnen functioneren. Met andere woorden, deze reactie op hypoxie is mogelijk niet specifiek voor EPO, maar eerder een wijdverspreid fenomeen in cellen. Deze andere cellen, die niet verantwoordelijk zijn voor de productie van EPO, moeten moleculen bevatten (zoals transcriptiefactoren die verantwoordelijk zijn voor het inschakelen van genexpressie) die veranderingen in de zuurstofconcentratie waarnemen en zich binden aan hypoxische responselementen om genen zoals EPO aan te zetten.