De tre vinnerne av 2019 Nobelprisen i fysiologi eller medisin, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza og Sir Peter J. Ratcliffe hadde allerede vunnet 2016 Lasker-prisen i grunnleggende medisin for sitt arbeid med hvordan celler sanser og tilpasser seg til hypoksi, så det var ikke spesielt overraskende. De oppdaget og identifiserte nøkkelmolekylet hypoksi-induserbar faktor 1 (HIF-1). I dag ønsker vi å gå tilbake til opprinnelsen til studien, som er erytropoietin, eller EPO, et mirakelmolekyl.

Det er den viktigste faktoren i produksjonen av røde blodlegemer

Røde blodlegemer er den vanligste typen blodceller i blodet, og er hovedmediet for transport av oksygen og karbondioksid gjennom virveldyrenes blod. Erytrocytter genereres i benmargen: Hematopoietiske stamceller prolifererer først og differensierer til stamceller til forskjellige blodceller, og erytroide stamceller kan ytterligere differensiere og modnes til erytrocytter. Under normale forhold er produksjonshastigheten for erytrocytter svært lav, men under stress som blødning, hemolyse og hypoksi kan erytrocyttproduksjonen økes med opptil åtte ganger. I denne prosessen er erytropoietin EPO en av de viktigste faktorene.

EPO er et hormon syntetisert hovedsakelig i nyrene. Dens kjemiske natur er et svært glykosylert protein. Hvorfor i nyrene? Omtrent en liter blod strømmer gjennom nyrene hvert minutt, slik at de raskt og effektivt kan oppdage endringer i oksygennivået i blodet. Når oksygennivået i blodet er lavt, reagerer nyrene raskt og produserer store mengder EPO. Sistnevnte sirkulerer gjennom blodet til benmargen, hvor det fremmer omdannelsen av erytroide stamceller til røde blodceller. Modne røde blodlegemer frigjøres fra benmargen til sirkulasjonssystemet for å forbedre kroppens evne til å binde seg til oksygen. Når nyrene merker en økning i oksygen i blodet, reduserer de EPO-produksjonen, som igjen reduserer mengden røde blodlegemer i benmargen.

Dette gir en perfekt justeringsløkke. Imidlertid møter mennesker som bor i stor høyde og noen anemipasienter ofte tilstanden med kontinuerlig lavt oksygennivå i blodet, som ikke kan fullføre sirkulasjonen ovenfor og stimulere nyrene til kontinuerlig å skille ut EPO, slik at blodets EPO-konsentrasjon er høyere enn vanlige mennesker.

Det tok nesten 80 år å avdekke det

Som mange store funn, har ikke forskernes forståelse av EPO vært problemfri, med spørsmål og utfordringer underveis. Det tok nesten 80 år fra konseptet med EPO til den endelige bestemmelsen av det spesifikke molekylet.

I 1906 injiserte franske forskere Carnot og Deflandre normale kaniner med serum fra anemiske kaniner og fant ut at antallet røde blodlegemer i plasmaet til normale kaniner økte. De mente at noen humorale faktorer i plasmaet kunne stimulere og regulere produksjonen av røde blodlegemer. Dette var den første EPO-konseptprototypen. Dessverre har ikke resultatene blitt replikert i de påfølgende tiårene, hovedsakelig fordi tellingen av nye røde blodlegemer ikke var nøyaktig.

Reissmann og Ruhenstroth-Bauers parabioseeksperiment i 1950 ga virkelig sterke bevis. De koblet kirurgisk sammen sirkulasjonssystemene til to levende rotter, og plasserte den ene i et hypoksisk miljø og den andre pustet inn normal luft. Som et resultat produserte begge musene enorme mengder røde blodlegemer. Det er ingen tvil om at det er et hormon i blodet som stimulerer produksjonen av røde blodceller, som EPO har fått navnet sitt fra. På den annen side er EPO veldig følsom for hypoksi.

Hvilket molekyl er EPO? Det tok den amerikanske forskeren Goldwasser 30 år å endelig avklare problemet på biokjemisk nivå. Hvis en arbeider ønsker å gjøre en god jobb, må han først skjerpe verktøyene sine. Funksjonen til EPO er å stimulere nye røde blodlegemer, mentellingen av sistnevnte er ikke nøyaktig. Det viktigste funksjonelle molekylet i røde blodceller er hemoglobinholdig hem, som inneholder et jernholdig ion i sentrum. Så Goldwassers team merket nyfødte røde blodceller med radioaktive jernisotoper og utviklet en sensitiv metode for å oppdage EPO-aktivitet. Dette gjør det mulig å isolere og rense svært lave konsentrasjoner av EPO (nanogram per milliliter) fra dyrevæskeprøver. Men isolasjonen av EPO var ekstremt vanskelig. De byttet fra nyre til anemisk saueplasma, til urin fra pasienter med alvorlig jernmangel på grunn av hakeorminfeksjon, og til slutt renset de i 1977 8 milligram humant EPO-protein fra 2550 liter urin fra japanske pasienter med aplastisk anemi.

I 1985 ble proteinsekvenseringen og genkloningen av humant EPO fullført. EPO-genet koder for et polypeptid med 193 aminorester, som blir et modent protein sammensatt av 166 aminosyrerester etter at signalpeptidet er klippet under sekresjon, og inneholder 4 steder for glykosyleringsmodifikasjon. I 1998 ble NMR-løsningsstrukturen til EPO og krystallstrukturen til EPO og dets reseptorkompleks analysert. På dette tidspunktet har folk den mest intuitive forståelsen av EPO.

Til nå har behandling for anemi vanligvis krevd blodoverføringer for å fylle på mangelen på røde blodlegemer. Etter hvert som folk lærer mer om EPO, har injisering av det for å stimulere produksjonen av røde blodlegemer i deres egen benmarg gjort problemet lettere. Men å rense EPO direkte fra kroppsvæsker, slik Goldwasser gjorde, er vanskelig og utbyttet er lavt. Bestemmelsen av EPO-protein og gensekvens gjorde det mulig å produsere rekombinant humant EPO i store mengder.

Det ble gjort av et bioteknologiselskap kalt Applied Molecular Genetics (Amgen). Amgen ble grunnlagt i 1980 med bare syv medlemmer, i håp om å lage biofarmasøytiske produkter med de da fremvoksende teknikkene innen molekylærbiologi. Interferon, veksthormonfrigjørende faktor, hepatitt B-vaksine, epidermal vekstfaktor var blant de varme navnene på listen over mål, men ingen av disse forsøkene lyktes. Fram til 1985 klonet Lin Fukun, en kinesisk vitenskapsmann fra Taiwan, Kina, genet til menneskelig EPO, og realiserte deretter produksjonen av syntetisk EPO ved bruk av DNA-rekombinasjonsteknologi.

Rekombinant humant EPO har samme sekvens som endogent EPO-protein, og har også lignende glykosyleringsmodifikasjon. Naturligvis har rekombinant humant EPO også aktiviteten til endogent EPO. I juni 1989 ble Amgens første produkt, rekombinant humant erytropoietin Epogen, godkjent av US FDA for behandling av anemi forårsaket av kronisk nyresvikt og anemi ved behandling av HIV-infeksjon. Epogen-salget toppet 16 millioner dollar på bare tre måneder. I løpet av de neste to tiårene dominerte Amgen markedet for remontert menneskelig EPO. Epogen ga Amgen 2,5 milliarder dollar i inntekter i 2010 alene. I 2018 var Amgens børsverdi 128,8 milliarder dollar, noe som gjør det til det åttende største farmasøytiske selskapet i verden.

Det er verdt å merke seg at Amgen opprinnelig jobbet med Goldwasser for å gi rensede humane EPO-proteiner for sekvensering, men Goldwasser og Amgen falt snart ut på grunn av ideologiske forskjeller. Goldwasser og hans University of Chicago, som gjorde grunnforskning, tenkte aldri på å patentere hormonet han oppdaget, og har derfor ikke fått en krone for EPOs enorme kommersielle suksess.

Det -- hvordan er det et sentralstimulerende middel

Når vi puster, kommer oksygen inn i cellenes mitokondrier for å drive respirasjonskjeden og produsere enorme mengder ATP, den viktigste energikilden i kroppen vår. Anemiske mennesker har ikke nok friske røde blodlegemer, og den mest umiddelbare effekten er at de ikke får i seg nok oksygen, noe som gjør at de føler seg trette, i likhet med pusteproblemer over lengre tid. Når de injiseres med rekombinant humant EPO, produserer kroppen til anemipasienter flere røde blodlegemer,bærer mer oksygen, og produserer mer av energimolekylet ATP, og lindrer effektivt symptomene.

Noen sportsarbeidere har imidlertid også begynt å tenke på rekombinant menneskelig EPO. Hvis det kunstige rekombinante hormonet av EPO-typen brukes til å stimulere idrettsutøvernes kropp til å produsere flere røde blodlegemer, er det mulig å forbedre idrettsutøvernes evne til å få oksygen og produsere energimolekyler, som også kan forbedre utøvernes ytelse i utholdenhet. arrangementer som sykling, langdistanseløp og langrenn. En artikkel fra 1980 i Journal of Applied Physiology viste at blodstimulerende midler (erytropoietin, kunstige oksygenbærere og blodtransfusjoner) kan øke utholdenheten med 34 prosent. Hvis idrettsutøvere bruker EPO, kan de løpe 8 kilometer på tredemøllen på 44 sekunder kortere tid enn før. Faktisk har sykling og maraton vært de verste forbryterne for EPO-stimulerende midler. Under Tour de France i 1998 ble en spansk laglege for Festina-laget arrestert ved den franske grensen med 400 flasker med kunstig rekombinant EPO! Resultatet var selvfølgelig at hele laget ble kastet ut av Touren og utestengt.

Den internasjonale olympiske komité la EPO til sin forbudte liste ved lekene i Barcelona i 1992, men å reorganisere menneskelig EPO-testing var så vanskelig at det før 2000-lekene ikke var mulig å oppdage om idrettsutøvere brukte det. Det er flere årsaker: 1) EPO-innholdet i kroppsvæsker er svært lavt, og EPO per ml blod hos normale mennesker er ca. 130-230 nanogram; 2) Aminosyresammensetningen til kunstig rekombinant EPO er nøyaktig den samme som for humant endogent EPO-protein, bare formen for glykosylering er veldig litt forskjellig; 3) Halveringstiden for EPO i blodet er bare 5-6 timer, og den er generelt uoppdagelig 4-7 dager etter siste injeksjon; 4) Det individuelle EPO-nivået er svært forskjellig, så det er vanskelig å etablere en absolutt kvantitativ standard.

Siden 2000 har WADA brukt urintesting som den eneste vitenskapelige verifiseringsmetoden for direkte påvisning av rekombinant EPO. På grunn av de små forskjellene mellom den glykoylerte formen av den kunstige rekombinante EPO og den til den menneskelige EPO, er de ladede egenskapene til de to molekylene svært små og kan skilles ut ved hjelp av en elektroforesemetode kalt isoelektrisk fokusering, som er hovedstrategien for direkte påvisning av det kunstige rekombinante EPO. Imidlertid viste noen rekombinante EPO uttrykt av humane avledede celler ingen forskjell i glykosylering, så noen eksperter foreslo at eksogent EPO og endogent EPO skulle skilles ut med forskjellig karbonisotopinnhold.

Faktisk er det fortsatt begrensninger i ulike testmetoder for EPO. For eksempel innrømmet Lance Armstrong, den amerikanske sykkellegenden, å ha tatt EPO og andre sentralstimulerende midler i løpet av sine syv Tour de France-seire, men han ble faktisk ikke bekreftet positiv for EPO i noen dopingtest på den tiden. Vi må fortsatt vente og se om det er «en fot høyere» eller «en fot høyere».

Hvordan blir det til en Nobelpris

Et siste ord om sammenhengen mellom EPO og 2019 Nobelprisen i fysiologi eller medisin.

EPO er det mest typiske tilfellet av menneskekroppens oppfatning og respons på hypoksi. Derfor valgte Semenza og Ratcliffe, to nobelprisvinnere, EPO som utgangspunkt for å studere mekanismen for celleoppfatning og tilpasning til hypoksi. Det første trinnet var å finne elementene i EPO-genet som kunne reagere på oksygenforandringer. Semenza identifiserte en nøkkel 256-baser ikke-kodende sekvens ved 3 'nedstrømsenden av genet som koder for EPO, kalt hypoksiresponselementet. Hvis denne elementsekvensen er mutert eller slettet, reduseres EPO-proteinets evne til å reagere på hypoksi sterkt. Hvis denne elementsekvensen er smeltet til nedstrøms 3'-enden av andre gener som ikke er assosiert med hypoksi, viser disse modifiserte genene også EPO-lignende aktiveringunder hypoksiforhold.

Ratcliffe og teamet hans oppdaget da at dette hypoksiske responselementet ikke bare er tilstede i nyre- eller levercellene som er ansvarlige for produksjonen av EPO, men også i mange andre celletyper som kan fungere under hypoksiske forhold. Med andre ord kan denne responsen på hypoksi ikke være spesifikk for EPO, men snarere et mer utbredt fenomen i celler. Disse andre cellene, som ikke er ansvarlige for EPO-produksjon, må inneholde molekyler (som transkripsjonsfaktorer som er ansvarlige for å slå på genuttrykk) som registrerer endringer i oksygenkonsentrasjon og binder seg til hypoksiske responselementer for å slå på gener som EPO.