Os três vencedores do Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza e Sir Peter J. Ratcliffe já haviam vencido o Prêmio Lasker de Medicina Básica de 2016 por seu trabalho sobre como as células sentem e se adaptam à hipóxia, por isso não foi particularmente surpreendente. Eles descobriram e identificaram a molécula-chave fator induzível por hipóxia 1 (HIF-1). Hoje queremos voltar à origem do estudo, que é a eritropoetina, ou EPO, uma molécula milagrosa.
É o fator mais importante na produção de glóbulos vermelhos
Os glóbulos vermelhos são o tipo mais abundante de células sanguíneas no sangue e são o principal meio de transporte de oxigênio e dióxido de carbono através do sangue de vertebrados. Os eritrócitos são gerados na medula óssea: as células-tronco hematopoiéticas primeiro proliferam e se diferenciam em progenitores de várias células sanguíneas, e os progenitores eritróides podem se diferenciar e amadurecer em eritrócitos. Em condições normais, a taxa de produção de eritrócitos humanos é muito baixa, mas sob estresse, como sangramento, hemólise e hipóxia, a taxa de produção de eritrócitos pode ser aumentada em até oito vezes. Nesse processo, a eritropoetina EPO é um dos fatores mais importantes.
A EPO é um hormônio sintetizado principalmente no rim. Sua natureza química é uma proteína altamente glicosilada. Por que nos rins? Cerca de um litro de sangue flui pelos rins a cada minuto, para que eles possam detectar rápida e eficientemente as mudanças nos níveis de oxigênio no sangue. Quando os níveis de oxigênio no sangue estão baixos, os rins respondem rapidamente e produzem grandes quantidades de EPO. Este último circula pela corrente sanguínea até a medula óssea, onde promove a conversão de células progenitoras eritroides em hemácias. Os glóbulos vermelhos maduros são liberados da medula óssea para o sistema circulatório para melhorar a capacidade do corpo de se ligar ao oxigênio. Quando os rins detectam um aumento de oxigênio no sangue, eles reduzem a produção de EPO, que por sua vez reduz a quantidade de glóbulos vermelhos na medula óssea.
Isso faz um loop de ajuste perfeito. No entanto, as pessoas que vivem em grandes altitudes e alguns pacientes com anemia geralmente encontram a condição de nível de oxigênio no sangue continuamente baixo, que não pode completar a circulação acima e estimular o rim a secretar EPO continuamente, de modo que a concentração de EPO no sangue seja maior do que as pessoas comuns.
Demorou quase 80 anos para descobri-lo
Como muitas grandes descobertas, a compreensão dos cientistas sobre o EPO não foi fácil, com perguntas e desafios ao longo do caminho. Demorou quase 80 anos desde o conceito de EPO até a determinação final da molécula específica.
Em 1906, os cientistas franceses Carnot e Deflandre injetaram em coelhos normais o soro de coelhos anêmicos e descobriram que a contagem de glóbulos vermelhos no plasma de coelhos normais aumentava. Eles acreditavam que alguns fatores humorais no plasma poderiam estimular e regular a produção de glóbulos vermelhos. Este foi o primeiro protótipo do conceito EPO. Infelizmente, os resultados não foram replicados nas décadas seguintes, principalmente porque a contagem de novos glóbulos vermelhos não era precisa.
O experimento de parabiose de Reissmann e Ruhenstroth-Bauer em 1950 forneceu evidências realmente fortes. Eles ligaram cirurgicamente os sistemas circulatórios de dois ratos vivos, colocando um em um ambiente hipóxico e o outro respirando ar normal. Como resultado, ambos os ratos produziram grandes quantidades de glóbulos vermelhos. Não há dúvida de que existe um hormônio na corrente sanguínea que estimula a produção de glóbulos vermelhos, de onde vem o nome EPO. Por outro lado, a EPO é muito sensível à hipóxia.
Que molécula é a EPO? O cientista americano Goldwasser levou 30 anos para finalmente esclarecer o problema no nível bioquímico. Se um trabalhador quer fazer um bom trabalho, ele deve primeiro afiar suas ferramentas. A função da EPO é estimular novos glóbulos vermelhos, masa contagem deste último não é precisa. A molécula funcional mais importante nos glóbulos vermelhos é a hemoglobina contendo heme, que contém um íon ferroso em seu centro. Assim, a equipe de Goldwasser rotulou glóbulos vermelhos recém-nascidos com isótopos radioativos de ferro e desenvolveu um método sensível para detectar a atividade da EPO. Isso torna possível isolar e purificar concentrações muito baixas de EPO (nanogramas por mililitro) de amostras de fluidos animais. Mas o isolamento da EPO foi extremamente difícil. Eles mudaram do rim para o plasma anêmico de ovelha, para a urina de pacientes com deficiência severa de ferro devido à infecção por ancilostomíase e, finalmente, em 1977, purificaram 8 miligramas de proteína EPO humana de 2.550 litros de urina de pacientes japoneses com anemia aplástica.
Em 1985, o sequenciamento da proteína e a clonagem do gene da EPO humana foram concluídos. O gene da EPO codifica um polipeptídeo com 193 resíduos de aminoácidos, que se torna uma proteína madura composta por 166 resíduos de aminoácidos após o peptídeo sinal ser cortado durante a secreção e contém 4 sítios para modificação da glicosilação. Em 1998, a estrutura da solução de RMN da EPO e a estrutura cristalina da EPO e seu complexo receptor foram analisados. Neste ponto, as pessoas têm a compreensão mais intuitiva do EPO.
Até agora, o tratamento para anemia geralmente exigia transfusões de sangue para repor a deficiência de glóbulos vermelhos. À medida que as pessoas aprendem mais sobre a EPO, injetá-la para estimular a produção de glóbulos vermelhos em sua própria medula óssea tornou o problema mais fácil. Mas purificar a EPO diretamente dos fluidos corporais, como fez Goldwasser, é difícil e os rendimentos são baixos. A determinação da proteína EPO e da sequência do gene tornou possível produzir EPO humana recombinante em grandes quantidades.
Foi feito por uma empresa de biotecnologia chamada Applied Molecular Genetics (Amgen). A Amgen foi fundada em 1980 com apenas sete membros, na esperança de fabricar biofármacos com as então emergentes técnicas de biologia molecular. Interferon, fator de liberação do hormônio do crescimento, vacina contra hepatite B, fator de crescimento epidérmico estavam entre os nomes quentes em sua lista de alvos, mas nenhuma dessas tentativas teve sucesso. Até 1985, Lin Fukun, um cientista chinês de Taiwan, China, clonou o gene da EPO humana e, em seguida, realizou a produção de EPO sintética usando a tecnologia de recombinação de DNA.
A EPO humana recombinante tem a mesma sequência que a proteína EPO endógena e também tem modificação de glicosilação semelhante. Naturalmente, a EPO humana recombinante também possui a atividade da EPO endógena. Em junho de 1989, o primeiro produto da Amgen, a eritropoietina humana recombinante Epogen, foi aprovado pela FDA dos Estados Unidos para o tratamento da anemia causada por insuficiência renal crônica e anemia no tratamento da infecção pelo HIV. As vendas da Epogen ultrapassaram US$ 16 milhões em apenas três meses. Nas duas décadas seguintes, a Amgen dominou o mercado de EPO humana remontada. A Epogen gerou US$ 2,5 bilhões em receita para a Amgen apenas em 2010. Em 2018, o valor de mercado da Amgen era de US$ 128,8 bilhões, tornando-a a oitava maior empresa farmacêutica do mundo.
Vale a pena notar que a Amgen inicialmente trabalhou com Goldwasser para fornecer proteínas EPO humanas purificadas para sequenciamento, mas Goldwasser e Amgen logo se desentenderam devido a diferenças ideológicas. Goldwasser e sua Universidade de Chicago, que faziam pesquisas básicas, nunca pensaram em patentear o hormônio que ele descobriu e, portanto, não receberam um centavo pelo enorme sucesso comercial do EPO.
Ele - como é um estimulante
Quando respiramos, o oxigênio entra nas mitocôndrias das células para conduzir a cadeia respiratória e produzir grandes quantidades de ATP, a principal fonte de energia em nossos corpos. As pessoas anêmicas não têm glóbulos vermelhos saudáveis suficientes, e o efeito mais imediato é que elas não absorvem oxigênio suficiente, o que as deixa cansadas, semelhantes a problemas respiratórios durante uma corrida longa. Quando injetados com EPO humana recombinante, os corpos dos pacientes com anemia produzem mais glóbulos vermelhos,transportam mais oxigênio e produzem mais da molécula de energia ATP, aliviando efetivamente os sintomas.
No entanto, alguns profissionais do esporte também começaram a pensar em EPO humana recombinante. Se o hormônio recombinante artificial do tipo EPO for usado para estimular o corpo dos atletas a produzir mais glóbulos vermelhos, é possível melhorar a capacidade dos atletas de obter oxigênio e produzir moléculas de energia, o que também pode melhorar o desempenho de atletas de resistência eventos como ciclismo, corrida de longa distância e esqui cross-country. Um artigo de 1980 no Journal of Applied Physiology mostrou que estimulantes do sangue (eritropoetina, transportadores artificiais de oxigênio e transfusões de sangue) podem aumentar a resistência em 34%. Se os atletas usarem o EPO, eles podem correr 8 quilômetros na esteira em 44 segundos a menos do que antes. Na verdade, o ciclismo e as maratonas têm sido os piores criminosos para os estimulantes de EPO. Durante o Tour de France de 1998, um médico espanhol da equipe Festina foi preso na fronteira francesa com 400 frascos de EPO recombinante artificial! O resultado, claro, foi que toda a equipe foi expulsa do Tour e banida.
O Comitê Olímpico Internacional adicionou a EPO à sua lista proibida nos Jogos de Barcelona de 1992, mas reorganizar os testes de EPO em humanos foi tão difícil que antes dos Jogos de 2000 não havia como detectar efetivamente se os atletas a estavam usando. Existem várias razões: 1) O conteúdo de EPO nos fluidos corporais é muito baixo, e EPO por ml de sangue em pessoas normais é de cerca de 130-230 nanogramas; 2) A composição de aminoácidos da EPO recombinante artificial é exatamente a mesma da proteína EPO endógena humana, apenas a forma de glicosilação é ligeiramente diferente; 3) A meia-vida da EPO no sangue é de apenas 5-6 horas, e geralmente é indetectável 4-7 dias após a última injeção; 4) O nível de EPO individual é muito diferente, por isso é difícil estabelecer um padrão quantitativo absoluto.
Desde 2000, a WADA tem usado o teste de urina como o único método de verificação científica para detecção direta de EPO recombinante. Devido às pequenas diferenças entre a forma glicoilada da EPO recombinante artificial e a da EPO humana, as propriedades carregadas das duas moléculas são muito pequenas e podem ser distinguidas por um método de eletroforese chamado focagem isoelétrica, que é a principal estratégia para a detecção direta da EPO recombinante artificial. No entanto, algumas EPO recombinantes expressas por células derivadas de humanos não mostraram diferença na glicosilação, então alguns especialistas sugeriram que a EPO exógena e a EPO endógena deveriam ser distinguidas por diferentes conteúdos de isótopos de carbono.
Na verdade, ainda existem limitações em diferentes métodos de teste para EPO. Por exemplo, Lance Armstrong, a lenda do ciclismo americano, admitiu ter tomado EPO e outros estimulantes durante suas sete vitórias no Tour de France, mas na verdade não foi confirmado positivo para EPO em nenhum teste de doping da época. Ainda temos que esperar para ver se é "um pé mais alto" ou "um pé mais alto".
Como isso faz um Prêmio Nobel
Uma palavra final sobre a conexão entre EPO e o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2019.
A EPO é o caso mais típico de percepção e resposta do corpo humano à hipóxia. Por isso, Semenza e Ratcliffe, dois prêmios Nobel, escolheram a EPO como ponto de partida para estudar o mecanismo de percepção e adaptação celular à hipóxia. O primeiro passo foi encontrar os elementos do gene EPO que poderiam responder às mudanças de oxigênio. Semenza identificou uma sequência chave não codificante de 256 bases na extremidade 3 'a jusante do gene que codifica a EPO, denominada elemento de resposta à hipóxia. Se esta sequência de elementos for mutada ou deletada, a capacidade da proteína EPO de responder à hipóxia é bastante reduzida. Se esta sequência de elementos for fundida à extremidade 3 'a jusante de outros genes não associados à hipóxia, esses genes modificados também mostrarão ativação semelhante à EPOem condições de hipóxia.
Ratcliffe e sua equipe descobriram então que esse elemento de resposta hipóxica não está presente apenas nas células renais ou hepáticas responsáveis pela produção de EPO, mas também em muitos outros tipos de células que podem funcionar em condições hipóxicas. Em outras palavras, essa resposta à hipóxia pode não ser específica da EPO, mas sim um fenômeno mais difundido nas células. Essas outras células, que não são responsáveis pela produção de EPO, devem conter moléculas (como fatores de transcrição responsáveis por ativar a expressão gênica) que detectam mudanças na concentração de oxigênio e se ligam a elementos de resposta hipóxica para ativar genes como a EPO.
