Traja víťazi Nobelovej ceny za fyziológiu a medicínu za rok 2019, William G. Kaelin, Jr., Gregg L. Semenza a Sir Peter J. Ratcliffe už získali Laskerovu cenu za základnú medicínu za rok 2016 za svoju prácu o tom, ako bunky vnímajú a prispôsobujú sa. k hypoxii, takže to nebolo zvlášť prekvapujúce. Objavili a identifikovali kľúčovú molekulu hypoxiou indukovateľný faktor 1 (HIF-1). Dnes sa chceme vrátiť k pôvodu štúdie, ktorou je erytropoetín alebo EPO, zázračná molekula.
Je to najdôležitejší faktor pri tvorbe červených krviniek
Červené krvinky sú najrozšírenejším typom krviniek v krvi a sú hlavným médiom na transport kyslíka a oxidu uhličitého krvou stavovcov. Erytrocyty sú generované v kostnej dreni: Hematopoetické kmeňové bunky sa najskôr množia a diferencujú sa na progenitory rôznych krvných buniek a erytroidné progenitory sa môžu ďalej diferencovať a dozrievať na erytrocyty. Za normálnych podmienok je rýchlosť tvorby ľudských erytrocytov veľmi nízka, ale pri strese, akým je krvácanie, hemolýza a hypoxia, sa môže rýchlosť tvorby erytrocytov zvýšiť až osemkrát. V tomto procese je jedným z najdôležitejších faktorov erytropoetín EPO.
EPO je hormón syntetizovaný hlavne v obličkách. Jeho chemická povaha je vysoko glykozylovaný proteín. Prečo v obličkách? Obličkami pretečie každú minútu asi liter krvi, takže dokážu rýchlo a efektívne zistiť zmeny hladiny kyslíka v krvi. Keď je hladina kyslíka v krvi nízka, obličky reagujú rýchlo a produkujú veľké množstvo EPO. Ten cirkuluje cez krvný obeh do kostnej drene, kde podporuje premenu erytroidných progenitorových buniek na červené krvinky. Zrelé červené krvinky sa uvoľňujú z kostnej drene do obehového systému, aby sa zlepšila schopnosť tela viazať kyslík. Keď obličky zaznamenajú zvýšenie kyslíka v krvi, znížia produkciu EPO, čo následne zníži množstvo červených krviniek v kostnej dreni.
To vytvára dokonalú slučku nastavenia. Ľudia žijúci vo vysokých nadmorských výškach a niektorí pacienti s anémiou sa však často stretávajú so stavom trvalo nízkej hladiny kyslíka v krvi, ktorá nedokáže dokončiť vyššie uvedený obeh a stimulovať obličky k nepretržitej sekrécii EPO, takže koncentrácia EPO v krvi je vyššia ako u bežných ľudí.
Jeho odhalenie trvalo takmer 80 rokov
Rovnako ako mnohé veľké objavy, ani pochopenie EPO vedcami nebolo hladké, s otázkami a výzvami. Od konceptu EPO po konečné určenie špecifickej molekuly trvalo takmer 80 rokov.
V roku 1906 francúzski vedci Carnot a Deflandre vstrekli normálnym králikom sérum anemických králikov a zistili, že počet červených krviniek v plazme normálnych králikov sa zvýšil. Verili, že niektoré humorálne faktory v plazme môžu stimulovať a regulovať tvorbu červených krviniek. Toto bol prvý prototyp konceptu EPO. Bohužiaľ, výsledky sa v nasledujúcich desaťročiach nezopakovali, hlavne preto, že počet nových červených krviniek nebol presný.
Experiment s parabiózou Reissmanna a Ruhenstrotha-Bauera v roku 1950 priniesol naozaj silné dôkazy. Chirurgicky prepojili obehové systémy dvoch živých potkanov, pričom jedného umiestnili do hypoxického prostredia a druhého dýchali normálny vzduch. Výsledkom bolo, že obe myši produkovali obrovské množstvo červených krviniek. Niet pochýb o tom, že v krvnom obehu sa nachádza hormón, ktorý stimuluje tvorbu červených krviniek, podľa čoho EPO dostal svoje meno. Na druhej strane je EPO veľmi citlivý na hypoxiu.
Aká molekula je EPO? Americkému vedcovi Goldwasserovi trvalo 30 rokov, kým konečne objasnil problém na biochemickej úrovni. Ak chce robotník odviesť dobrú prácu, musí si najskôr nabrúsiť nástroje. Funkciou EPO je stimulovať nové červené krvinky, alepočet tých druhých nie je presný. Najdôležitejšou funkčnou molekulou v červených krvinkách je hemoglobín obsahujúci hém, ktorý vo svojom strede obsahuje železnatý ión. Goldwasserov tím teda označil novorodenecké červené krvinky rádioaktívnymi izotopmi železa a vyvinul citlivú metódu na detekciu aktivity EPO. To umožňuje izolovať a čistiť veľmi nízke koncentrácie EPO (nanogramy na mililiter) zo vzoriek zvieracej tekutiny. Ale izolácia EPO bola mimoriadne náročná. Prešli z obličkovej na anemickú ovčiu plazmu, do moču pacientov s ťažkým nedostatkom železa v dôsledku infekcie ankylostomikátom a napokon v roku 1977 vyčistili 8 miligramov ľudského proteínu EPO z 2 550 litrov moču japonských pacientov s aplastickou anémiou.
V roku 1985 bolo dokončené sekvenovanie proteínov a génové klonovanie ľudského EPO. Gén EPO kóduje polypeptid so 193 aminokyselinovými zvyškami, ktorý sa po odstrihnutí signálneho peptidu počas sekrécie stáva zrelým proteínom zloženým zo 166 aminokyselinových zvyškov a obsahuje 4 miesta na modifikáciu glykozylácie. V roku 1998 bola analyzovaná štruktúra roztoku EPO NMR a kryštalická štruktúra EPO a jeho receptorového komplexu. V tomto bode ľudia najviac intuitívne chápu EPO.
Doteraz liečba anémie zvyčajne vyžadovala krvné transfúzie na doplnenie nedostatku červených krviniek. Keď sa ľudia dozvedeli viac o EPO, jeho injekčné podanie na stimuláciu tvorby červených krviniek v ich vlastnej kostnej dreni tento problém uľahčilo. Ale čistenie EPO priamo z telesných tekutín, ako to urobil Goldwasser, je ťažké a výťažky sú nízke. Stanovenie proteínu EPO a sekvencie génu umožnilo produkovať rekombinantný ľudský EPO vo veľkých množstvách.
Urobila to biotechnologická spoločnosť s názvom Applied Molecular Genetics (Amgen). Spoločnosť Amgen bola založená v roku 1980 s iba siedmimi členmi v nádeji, že bude vyrábať biofarmaceutiká pomocou vtedy vznikajúcich techník molekulárnej biológie. Interferón, faktor uvoľňujúci rastový hormón, vakcína proti hepatitíde B, epidermálny rastový faktor patrili medzi horúce mená na ich zozname cieľov, ale žiadny z týchto pokusov nebol úspešný. Do roku 1985 Lin Fukun, čínsky vedec z Taiwanu v Číne, klonoval gén ľudského EPO a potom realizoval výrobu syntetického EPO pomocou technológie rekombinácie DNA.
Rekombinantný ľudský EPO má rovnakú sekvenciu ako endogénny proteín EPO a má tiež podobnú modifikáciu glykozylácie. Prirodzene, rekombinantný ľudský EPO má tiež aktivitu endogénneho EPO. V júni 1989 prvý produkt spoločnosti Amgen, rekombinantný ľudský erytropoetín Epogen, schválila americká FDA na liečbu anémie spôsobenej chronickým zlyhaním obličiek a anémie pri liečbe infekcie HIV. Tržby Epogenu presiahli 16 miliónov dolárov len za tri mesiace. Počas nasledujúcich dvoch desaťročí spoločnosť Amgen dominovala na trhu so znovu zostaveným ľudským EPO. Spoločnosť Epogen priniesla spoločnosti Amgen len v roku 2010 príjmy vo výške 2,5 miliardy dolárov. V roku 2018 bola hodnota Amgenu na akciovom trhu 128,8 miliardy dolárov, čo z neho robí ôsmu najväčšiu farmaceutickú spoločnosť na svete.
Stojí za zmienku, že Amgen pôvodne spolupracoval s Goldwasserom, aby poskytli purifikované ľudské EPO proteíny na sekvenovanie, ale Goldwasser a Amgen sa čoskoro rozišli kvôli ideologickým rozdielom. Goldwasser a jeho University of Chicago, ktorí robili základný výskum, nikdy neuvažovali o patentovaní hormónu, ktorý objavil, a tak nedostali ani cent za obrovský komerčný úspech EPO.
To -- ako je to stimulant
Keď dýchame, kyslík vstupuje do mitochondrií buniek, aby poháňal dýchací reťazec a produkoval obrovské množstvo ATP, hlavného zdroja energie v našom tele. Chudokrvní ľudia nemajú dostatok zdravých červených krviniek a najbezprostrednejší efekt je ten, že neprijímajú dostatok kyslíka, vďaka čomu sa cítia unavení, podobne ako pri problémoch s dýchaním pri dlhom behu. Pri injekcii rekombinantného ľudského EPO telo pacientov s anémiou produkuje viac červených krviniek,prenášať viac kyslíka a produkovať viac energetickej molekuly ATP, čím účinne zmierňuje symptómy.
Niektorí športoví pracovníci však začali uvažovať aj o rekombinantnom ľudskom EPO. Ak sa použije umelý rekombinantný hormón typu EPO na stimuláciu organizmu športovcov k väčšej produkcii červených krviniek, je možné zlepšiť schopnosť športovcov získavať kyslík a produkovať molekuly energie, čo môže zlepšiť aj výkonnosť športovcov vo vytrvalosti. podujatia ako cyklistika, beh na dlhé trate a beh na lyžiach. Článok z roku 1980 v časopise Journal of Applied Physiology ukázal, že stimulanty krvi (erytropoetín, umelé nosiče kyslíka a krvné transfúzie) môžu zvýšiť vytrvalosť o 34 percent. Ak športovci používajú EPO, môžu zabehnúť 8 kilometrov na bežiacom páse za 44 sekúnd kratšieho času ako doteraz. Cyklistika a maratóny boli v skutočnosti najhoršími zločincami pre stimulanty EPO. Počas Tour de France v roku 1998 bol na francúzskych hraniciach zatknutý španielsky lekár tímu Festina so 400 fľašami umelého rekombinantného EPO! Výsledkom samozrejme bolo, že celý tím bol vyhodený z Tour a zakázaný.
Medzinárodný olympijský výbor pridal EPO na svoj zakázaný zoznam na hrách v Barcelone v roku 1992, ale reorganizácia testovania ľudského EPO bola taká náročná, že pred hrami v roku 2000 neexistoval spôsob, ako efektívne zistiť, či ho športovci používajú. Existuje niekoľko dôvodov: 1) obsah EPO v telesných tekutinách je veľmi nízky a EPO na ml krvi u normálnych ľudí je asi 130-230 nanogramov; 2) Aminokyselinové zloženie umelého rekombinantného EPO je presne rovnaké ako zloženie ľudského endogénneho EPO proteínu, len forma glykozylácie je veľmi mierne odlišná; 3) Polčas rozpadu EPO v krvi je len 5-6 hodín a vo všeobecnosti je nedetegovateľný 4-7 dní po poslednej injekcii; 4) Jednotlivé úrovne EPO sú veľmi rozdielne, takže je ťažké stanoviť absolútny kvantitatívny štandard.
Od roku 2000 WADA používa testovanie moču ako jedinú vedeckú overovaciu metódu na priamu detekciu rekombinantného EPO. Kvôli malým rozdielom medzi glykoylovanou formou umelého rekombinantného EPO a ľudským EPO sú nabité vlastnosti týchto dvoch molekúl veľmi malé a možno ich rozlíšiť metódou elektroforézy nazývanou izoelektrická fokusácia, ktorá je hlavnou stratégiou priama detekcia umelého rekombinantného EPO. Niektoré rekombinantné EPO exprimované bunkami odvodenými od človeka však nevykazovali žiadny rozdiel v glykozylácii, takže niektorí odborníci navrhli, že exogénny EPO a endogénny EPO by sa mali odlišovať rôznym obsahom izotopov uhlíka.
V skutočnosti stále existujú obmedzenia v rôznych testovacích metódach pre EPO. Napríklad Lance Armstrong, americká cyklistická legenda, priznal, že bral EPO a iné stimulanty počas svojich siedmich víťazstiev na Tour de France, ale v skutočnosti nebol vtedy potvrdený ako pozitívny na EPO v žiadnom dopingovom teste. Musíme ešte počkať a uvidíme, či je "o stopu vyššie" alebo "o stopu vyššie".
Ako to robí Nobelovu cenu
Posledné slovo o spojení medzi EPO a Nobelovou cenou za fyziológiu alebo medicínu za rok 2019.
EPO je najtypickejším prípadom vnímania a reakcie ľudského tela na hypoxiu. Preto si Semenza a Ratcliffe, dvaja laureáti Nobelovej ceny, vybrali EPO ako východiskový bod na štúdium mechanizmu vnímania buniek a adaptácie na hypoxiu. Prvým krokom bolo nájsť prvky génu EPO, ktoré by mohli reagovať na zmeny kyslíka. Semenza identifikovala kľúčovú 256-bázovú nekódujúcu sekvenciu na 3' konci génu kódujúceho EPO, nazvanú prvok odozvy na hypoxiu. Ak je táto sekvencia prvkov zmutovaná alebo deletovaná, schopnosť EPO proteínu reagovať na hypoxiu je značne znížená. Ak je táto sekvencia prvkov fúzovaná s downstream 3' koncom iných génov, ktoré nie sú spojené s hypoxiou, tieto modifikované gény tiež vykazujú aktiváciu podobnú EPOv podmienkach hypoxie.
Ratcliffe a jeho tím potom zistili, že tento prvok hypoxickej odozvy nie je prítomný len v obličkových alebo pečeňových bunkách zodpovedných za produkciu EPO, ale aj v mnohých iných typoch buniek, ktoré môžu fungovať za hypoxických podmienok. Inými slovami, táto reakcia na hypoxiu nemusí byť špecifická pre EPO, ale skôr rozšírený jav v bunkách. Tieto ďalšie bunky, ktoré nie sú zodpovedné za produkciu EPO, musia obsahovať molekuly (ako sú transkripčné faktory zodpovedné za zapnutie génovej expresie), ktoré snímajú zmeny v koncentrácii kyslíka a viažu sa na prvky hypoxickej odozvy, aby zapli gény, ako je EPO.
