2019 年諾貝爾生理學或醫學獎的三位獲得者 William G. Kaelin, Jr.、Gregg L. Semenza 和 Sir Peter J. Ratcliffe 已經因其在細胞如何感知和適應方面的工作而獲得 2016 年拉斯克基礎醫學獎缺氧，所以這並不特別令人驚訝。他們發現並鑑定了關鍵分子缺氧誘導因子 1 (HIF-1)。今天我們要回到研究的原點，即促紅細胞生成素，即EPO，一種神奇的分子。

它是紅細胞生成中最重要的因素

紅細胞是血液中含量最多的一類血細胞，是脊椎動物血液中輸送氧氣和二氧化碳的主要介質。紅細胞在骨髓中產生：造血幹細胞首先增殖分化為各种血細胞的祖細胞，紅系祖細胞進一步分化成熟為紅細胞。正常情況下，人體紅細胞生成率很低，但在出血、溶血、缺氧等應激條件下，紅細胞生成率最多可提高8倍。在這個過程中，促紅細胞生成素EPO是最重要的因素之一。

EPO 是一種主要在腎臟合成的激素。它的化學性質是一種高度糖基化的蛋白質。為什麼在腎臟？每分鐘大約有一升血液流過腎臟，因此它們可以快速有效地檢測血液中氧氣水平的變化。當血液中的氧氣含量低時，腎臟會迅速做出反應並產生大量的 EPO。後者通過血流循環到骨髓，在那裡它促進紅系祖細胞轉化為紅細胞。成熟的紅細胞從骨髓中釋放到循環系統中，以提高身體與氧氣結合的能力。當腎臟感覺到血液中的氧氣增加時，它們會減少 EPO 的產生，從而減少骨髓中紅細胞的數量。

這是一個完美的調整環。但是，生活在高海拔地區的人和一些貧血患者經常會遇到血氧持續偏低的情況，無法完成上述循環，刺激腎臟不斷分泌EPO，使血液中EPO濃度高於常人。

花了將近80年才被發現

與許多重大發現一樣，科學家們對 EPO 的理解並非一帆風順，一路上充滿了疑問和挑戰。從EPO的概念到最終確定具體分子，歷時近80年。

1906年，法國科學家Carnot和Deflandre將貧血兔的血清注射到正常兔體內，發現正常兔血漿中紅細胞計數升高。他們認為血漿中的一些體液因子可以刺激和調節紅細胞的產生。這是第一個 EPO 概念原型。不幸的是，結果在隨後的幾十年裡沒有被複製，主要是因為新紅細胞的計數不准確。

Reissmann 和 Ruhenstroth-Bauer 在 1950 年的聯生實驗提供了非常有力的證據。他們通過手術將兩隻活老鼠的循環系統連接起來，將一隻置於缺氧環境中，另一隻呼吸正常空氣。結果，兩隻老鼠都產生了大量的紅細胞。毫無疑問，血液中有一種激素可以刺激紅細胞的產生，EPO 也由此得名。另一方面，EPO對缺氧非常敏感。

EPO是什麼分子？美國科學家戈德瓦瑟歷時30年，終於從生化層面弄清了這個問題。工欲善其事，必先利其器。 EPO的作用是刺激新的紅細胞，但後者的計數不准確。紅細胞中最重要的功能分子是含血紅素的血紅蛋白，它的中心含有一個亞鐵離子。因此，Goldwasser 的團隊用放射性鐵同位素標記新生紅細胞，並開發了一種檢測 EPO 活性的靈敏方法。這使得從動物體液樣品中分離和純化極低濃度的 EPO（納克/毫升）成為可能。但EPO的分離極其困難。他們從腎臟換成貧血的綿羊血漿，再換成鉤蟲感染導致嚴重缺鐵的患者的尿液，最後在 1977 年從日本再生障礙性貧血患者的 2,550 升尿液中純化出 8 毫克人類 EPO 蛋白。

1985年，完成了人EPO的蛋白質測序和基因克隆。 EPO基因編碼193個氨基酸殘基的多肽，在分泌過程中信號肽被剪斷後成為由166個氨基酸殘基組成的成熟蛋白，含有4個糖基化修飾位點。 1998年分析了EPO的NMR溶液結構和EPO及其受體複合物的晶體結構。至此，人們對EPO有了最直觀的認識。

迄今為止，貧血的治療通常需要輸血來補充紅細胞的不足。隨著人們對 EPO 的了解越來越多，將其註射到自己的骨髓中以刺激紅細胞生成使問題變得更加容易。但像 Goldwasser 所做的那樣，直接從體液中純化 EPO 很困難，而且收率很低。 EPO蛋白和基因序列的確定，使大量生產重組人EPO成為可能。

它是由一家名為 Applied Molecular Genetics (Amgen) 的生物技術公司完成的。 Amgen 成立於 1980 年，當時只有七名成員，希望利用當時新興的分子生物學技術製造生物製藥。干擾素、生長激素釋放因子、乙型肝炎疫苗、表皮生長因子是他們目標清單上的熱門名字，但這些嘗試都沒有成功。直到1985年，來自中國台灣的華人科學家林福坤克隆了人類EPO的基因，然後利用DNA重組技術實現了合成EPO的生產。

重組人EPO與內源性EPO蛋白具有相同的序列，也有相似的糖基化修飾。自然地，重組人EPO也具有內源性EPO的活性。 1989年6月，安進公司的第一個產品重組人促紅細胞生成素Epogen被美國FDA批准用於治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和治療HIV感染引起的貧血。 Epogen 的銷售額在短短三個月內就突破了 1600 萬美元。在接下來的二十年裡，安進公司主導了重組人 EPO 市場。 Epogen 僅在 2010 年就為安進公司帶來了 25 億美元的收入。 2018年，安進的股票市值為1288億美元，成為全球第八大製藥公司。

值得注意的是，安進最初與Goldwasser合作，提供純化的人EPO蛋白用於測序，但很快Goldwasser和安進就因為意識形態的分歧鬧翻了。 Goldwasser 和他的芝加哥大學從事基礎研究，從未想過為他發現的激素申請專利，因此沒有從 EPO 的巨大商業成功中得到一分錢。

它——它是怎樣一種興奮劑

當我們呼吸時，氧氣進入細胞的線粒體以驅動呼吸鏈並產生大量的 ATP，這是我們身體的主要能量來源。貧血的人沒有足夠的健康紅血球，最直接的影響就是沒有攝入足夠的氧氣，使人感到疲倦，類似於長跑時的呼吸問題。當注射重組人EPO時，貧血患者體內會產生更多的紅細胞，攜帶更多的氧氣，產生更多的能量分子ATP，有效緩解症狀。

不過，一些體育工作者也開始想到重組人EPO。如果利用EPO型人工重組激素，刺激運動員身體產生更多的紅細胞，就有可能提高運動員獲得氧氣和產生能量分子的能力，也可以提高運動員的耐力表現騎自行車、長跑和越野滑雪等項目。 《應用生理學雜誌》1980 年的一篇論文表明，血液興奮劑（促紅細胞生成素、人工氧載體和輸血）可以將耐力提高 34%。如果運動員使用 EPO，他們可以在跑步機上跑 8 公里，時間比以前少​​ 44 秒。事實上，騎自行車和馬拉松是促紅細胞生成素興奮劑最嚴重的罪魁禍首。 1998年環法自行車賽期間，Festina隊的一名西班牙隊醫在法國邊境攜帶400瓶人工重組EPO被捕！結果當然是整支球隊都被踢出巡迴賽並被禁賽。

國際奧委會在 1992 年巴塞羅那奧運會上將 EPO 列入禁用名單，但重新組織人體 EPO 測試非常困難，以至於在 2000 年奧運會之前沒有辦法有效檢測運動員是否使用它。有幾個原因：1）體液中EPO含量很低，正常人每毫升血液中EPO約為130-230毫微克； 2) 人工重組EPO的氨基酸組成與人內源性EPO蛋白完全相同，僅糖基化形式略有不同； 3）EPO在血液中的半衰期只有5-6小時，一般在末次注射後4-7天檢測不到； 4）個體EPO水平差異很大，難以建立絕對的量化標準。

2000年起，WADA將尿液檢測作為直接檢測重組EPO的唯一科學驗證方法。由於人工重組 EPO 的糖基化形式與人 EPO 的糖基化形式存在細微差異，兩種分子的帶電特性非常小，可以通過稱為等電聚焦的電泳方法區分，這是主要策略直接檢測人工重組EPO。但部分人源細胞表達的重組EPO在糖基化上無差異，因此有專家建議應通過碳同位素含量的不同來區分外源性EPO和內源性EPO。

事實上，EPO的不同檢測方法仍然存在局限性。例如，美國自行車傳奇蘭斯·阿姆斯特朗承認在他的七次環法自行車賽勝利期間服用了 EPO 和其他興奮劑，但當時在任何興奮劑檢查中都沒有實際證實 EPO 呈陽性。是“高一尺”還是“高一尺”，我們還需拭目以待。

它是如何獲得諾貝爾獎的

最後說一下 EPO 與 2019 年諾貝爾生理學或醫學獎之間的聯繫。

EPO是人體對缺氧的感知和反應最典型的例子。因此，兩位諾貝爾獎獲得者Semenza和Ratcliffe選擇EPO作為研究細胞感知和適應缺氧機制的起點。第一步是找到能夠響應氧氣變化的 EPO 基因元素。 Semenza 在編碼 EPO 的基因的 3' 下游識別出一個關鍵的 256 鹼基非編碼序列，命名為缺氧反應元件。如果這個元件序列發生突變或缺失，EPO蛋白對缺氧的反應能力就會大大降低。如果該元件序列與其他與缺氧無關的基因的下游 3' 端融合，這些修飾基因也表現出 EPO 樣激活在缺氧條件下。

Ratcliffe 和他的團隊隨後發現，這種缺氧反應元件不僅存在於負責產生 EPO 的腎臟或肝臟細胞中，而且還存在於許多其他可以在缺氧條件下發揮作用的細胞類型中。換句話說，這種對缺氧的反應可能不是 EPO 特有的，而是細胞中更普遍的現象。這些不負責產生 EPO 的其他細胞必須包含分子（例如負責開啟基因表達的轉錄因子），這些分子可以感知氧氣濃度的變化並與缺氧反應元件結合以開啟 EPO 等基因。